ilkmrna在结肠癌细胞株中的表达及其稳定表达的rna干扰载体构建论文

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1、ILKmRNA在结肠癌细胞株中的表达及其稳定表达的RNA干扰载体构建论文【摘要】［目的］检测结肠癌细胞株中ILK的mRNA水平，并构建针对ILK基因的特异性RNA干扰(RNAi)表达载体。［方法］通过RT-PCR检测ILK基因在三种结肠癌细胞株（Sethods］TheexpressionofILKmRNAacelllines（SolecularAnalysis程序使PCR产物条带在计算机上显像，并应用BandScan软件分析ILK基因与β-actin条带光密度比，比值小于0.1时为阴性或低度表达，比值大于0.1小于0.4时为中度表达，大于0.4为高度表达。1．3．3RN

2、A干扰载体的构建根据报道ILKsiRNA序列10及已发表的基因库中ILK基因的mRNA序列，利用软件设计，按照Oligoengine提供的pSUPER-RNAiSystem中构建发夹状短链RNA的原则，5′→3′分别为BglⅡ酶切位点＋靶向正义链＋发夹状结构＋靶向反义链＋终止序列HindⅢ酶切位点，设计为：senseILK为：5′-GATCCCCCTCGTTGAGCTTCGTCAGGTTCAAGA-GACCTGACGAAGCTCAACGAGTTTTTA-3′，antisenseILK为：5′-AGCTTAAAAACTCGTTGAGCTTCGT-CAGGTCTCTTGAA

3、CCTGACGAAGCTCAACGAGGG-G-3′。无关基因对照组sense-Control为：5′-GATCCCCTCCGTTGAGCTTCGTCAGGTTCAAGAGA-CCTGACGAAGCTCAACGGATTTTTA-3′，antisense-Control为：5′-AGCTTAAAAATCCGTTGAGCTTCGT-CAGGTCTCTTGAACCTGACGAAGCTCAACGAGGG-G-3′。将合成的单链稀释为3μg/μl，退火成双链，于4℃保存。用BglⅡ及HindⅢ双酶切质粒pSNE，1.0%琼脂糖凝胶电泳30min，纯化回收线性化质粒pSNE（按照B

4、ioDev胶回收试剂盒说明书进行）。T4DNA连接酶连接线性化质粒pSNE和退火产物，以线性化质粒pSNE和灭菌水连接做阴性对照。4℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（感受态细胞制备和转化参照《分子克隆指南》），在氨苄青霉素抗性的LB平板上37℃培养过夜筛选，随机挑取菌落，扩增培养后，抽提并纯化质粒，用EcoRⅠ及HindⅢ双酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定（阳性为281bp，阴性为227bp）。酶切鉴定正确的进一步测序鉴定。1．3．4RNA干扰载体细胞转染应用Lipofectamine2000转染结肠癌细胞HT-29。转染前一天，用0.25％胰酶溶液消化对数生

5、长期的HT-29细胞，制成单细胞悬液，接种到24孔板中，接种密度大约为1.5×105/孔，每孔加入500μl含20%小牛血清的H-DMEM培养液。转染步骤详见Invitrogen的Lipofectamine2000产品使用说明书。转染48h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。以1000μg/ml浓度的G418压力筛选，以未转染的HT-29细胞为阴性对照。获得稳定表达的HT-29/pSNE-ILK细胞后，做RT-PCR进一步验证干扰效率，干扰效率＝（1-干扰组/对照组）×100%。1．3．5统计学方法各项计量资料均以x±s表示，应用SPSS13.0版统计分析软件进行数据分析

6、，采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2．1ILKmRNA在结肠癌细胞系中的表达经RT-PCR扩增，ILK基因扩增片段长度为406bp，β-actin扩增片段长度为500bp，与实验设计符合。电泳结果直接用Bio-Rad凝胶摄影系统保存，用BandScan软件进行分析，2条带光密度比(ILK/β-actin)为基因表达的相对值：SontgomeryMK,etal.Potentandspecificgeicinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditselegansJ.Nature,1998,391（6669）:

7、806-811.9刘峰,王丽,王培林．RNA干扰临床应用的研究进展J．国外医学遗传分册,2004,27(1)：11-l5．10DuxburyMS,ItoH,BenoitE,etal.RNAInterferencedemonstratesaNovelroleforintegrin-linkedkinaseasadeterminantofpancreaticadenocarcinomacellgemcitabinechemoresistanceJ.ClinCancerRes,2005,11(9)：3433-3438.11GraffJR,Ded