survivin基因靶向rna干扰重组表达载体的构建和测序论文

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1、Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序论文【关键词】SurvivinCloningandsequencingofrebinantplasmidaffectingsurvivingenetranslationbyRNAinterferencetechnique【Abstract】AIM:ToclonetherebinantplasmidaffectingsurvivingenetranslationbyRNAinterferenceandtoanalyzethenucleicacidsequenceofthe

2、rebinantplasmidforneors.METHODS:TallhairpinstructureentformidedintostrainDH5α.Theplasmididentifiedbyrestrictionenzymeidedsequenceidhelpstofindaneors.【Keyid【摘要】目的：利用RNA干扰(RNAi)技术，以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体，并进行测序鉴定.方法：设计具有短发夹结构的两条DNA序列，经退火成互补双链，再克隆至载体pSilencer3.1H1hygro

3、中构建重组表达载体，转化DH5α菌株，提取质粒行酶切鉴定后，并进行序列测定.结果：将合成的DNA序列退火后克隆到载体上.freelRNA转录，供抗肿瘤研究参考.【关键词】survivin基因；RNA干扰；重组表达载体0引言RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近几年发展起来的新技术.用小片段RNA二聚体(smallinterferingRNA,siRNA)对高等哺乳动物细胞进行转导，成功排除了长片段双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)在哺乳动物细胞内引起非特异性干扰的现象，但其主要障碍

4、是长于30nt的双链RNA将激活抗病毒机制，导致非特异性的RNA转录降解.而体外合成21nt的siRNA能够成功地特异性抑制哺乳动物的基因表达［1-3］.本实验我们针对凋亡抑制蛋白(inhibitionapoptosisprotein,IAP)基因家族的survivin基因的短发夹结构RNA(smallhairpinRNA,shRNA)构建重组表达载体，为体外和体内抗肿瘤研究提供平台.1材料和方法1.1材料含有人H1启动子的pSilencer3.1H1hygro质粒为美国Ambion公司产品，由西南医院皮肤科王继文博士赠送.克

5、隆用大肠杆菌DH5α由本校烧伤科实验室董征学硕士赠送.限制性内切酶BamHⅠ,HindⅢ及T4DNA连接酶、核酸分子质量标准λHindⅢdigest,DL2000均为TaKaRa公司产品.E.Z.N.AR质粒小量抽提试剂盒、E.Z.N.AR胶回收试剂盒均为美国Omega公司产品.1.2方法1.2.1Survivin基因干扰片段shRNA的设计与合成氯化钙法制备DH5α大肠杆菌感受态细胞冻存于-70℃备用；扩增和纯化质粒pSilencer3.1H1hygro.根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列(NoNM00

6、1168)，参考shRNA设计原则进行设计［4］，最后选择出三条片段作为survivin基因干扰片段.以间隔序列连接干扰片段正向和反向序列，两端加酶切位点，最后得到具有回文结构和发夹结构(hairpinsiRNA)的干扰片段序列，并将其送北京赛百盛生物试剂公司合成.1.2.2pSilencer3.1H1hygrosiRNA表达载体的构建将每对要退火的两条片段分别取2μL与46μL退火缓冲液混合，利用PCR仪加热至95℃3min，然后70℃水浴,自然冷却至室温.用45μL的无酶去离子水稀释5μL的退火双链，使其终浓度为8mg/L

7、.载体pSilencer3.1H1hygro经BamHⅠ和HindⅢ双酶切.将退火片段与经酶切后的载体按摩尔比3∶1的比例进行连接反应，同时设立阴性对照和质粒pSilencer3.1H1hygro的阳性对照反应，置16℃过夜.将连接产物各取4μL分别接种于100μL的DH5α感受态细胞中进行转化.挑取单菌落扩增培养，E.Z.N.AR质粒小量抽提试剂盒进行质粒试抽提.用限制性内切酶BglⅡ分别对重组质粒进行单酶切(此位点为目的序列所特有的酶切位点)鉴定.得到的重组质粒分别命名为pSilencer3.1H1hygrosiRNA1,

8、pSilencer3.1H1hygrosiRNA2,pSilencer3.1H1hygrosiRNA3.1.2.3重组质粒测序鉴定将鉴定证实后的三个重组质粒各取1管菌液送大连宝生物工程有限公司测序.所用引物为M13+.2结果2.1载体双酶切鉴定回收酶切产物行12g/L琼脂糖凝