携带靶向干扰vegf基因shrna 重组腺相关病毒载体的构建和制备论文

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1、携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备论文王卫东陈长生蒋立新【摘要】AIM:Toconstructandpreparetherebinantadenoassociatedvirus(AAV)vectorforexpressingshorthairpinRNA(shRNA)targetingVEGF165mRNA.METHODS:ByinsertingthesequencethatcontainedEGFPU6shRNA(targetingVEGF165mRNA)intotheEcoRIandSal

2、IsiteofvectorplasmidpSNAV2.0laczα,idpSNAV2.0EGFPU6shRNA（VEGF165）.Therebinantvectorofplasmid,BHKcelllinesandhelpervirusHSV1RapCap/ΔUL2ethodsofPCR,SDSPAGE,dotblot,andvirusinfection,respectively.RESULTS:TheresultsofPCRandSDSPAGEindicatedthattheshRNAfragmenttarg

3、etingVEGF165ately3×1014v.g.(vectorgenomes)/L,andthepositiverateofrAAV2infectedcellsicinjurybyspeciallyinhibitingtheexpressionofVEGFgene.【关键词】血管内皮生长因子类腺相关病毒遗传载体RNA干扰短发卡样RNA0引言血管内皮生长因子（vascularendothelialgroRNA和VEGF表达水平的升高，对抗缺血所致的损害、发挥神经保护作用［1-2］.本研究中，我们设计、构建了携带靶向干扰VEG

4、F基因的短发卡样RNA（shorthairpinRNA，shRNA）腺相关病毒（Adenoassociatedvirus）载体.freelin，冰水浴.取1μL为模板，使用前述鉴定引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定靶向干扰VEGF165基因的shRNA被包装入rAAV2病毒.1．2．4重组病毒SDSPAGE分析病毒纯度灌制SDSPAGE分离胶和积层胶，取病毒原液10μL，2×loadingbuffer混合后，于100℃煮沸5min，冰水浴.取10μL加样常规电泳约2h，考马斯亮蓝振荡染色，脱色液脱色.Alphai

5、mager图像扫描仪检测病毒纯度.1．2．5重组病毒物理滴度测定采用点杂交法测定重组病毒的物理滴度(以载体基因组数量/L表示，即v.g./L).具体方法步骤简述如下：①PCR方法标记探针.以pSNAV2.0EGFP质粒DNA为模板，引物序列：CMVF5′CGGTGTCTTCTATGGAGGT3′；CMVR5′GGCAGTACATCTACGTATTAG3′.②探针回收、纯化.向50μL的PCR反应溶液中加入5μL4mol/LLiCl和150μL预冷的无水乙醇，置于-20℃2h，12000r/min4℃离心10min，700m

6、L/L乙醇洗涤沉淀、纯化，20μLpH8.0的TE缓冲液重悬备用.③取待检病毒样品10μL，加入9μLddH2O,.freelg/L）于100℃煮沸10min，立即置于冰水中；④将2倍比梯度稀释对照质粒各取1μL，点一排于尼龙膜上，变性后病毒样品点于尼龙膜上另外一排，120℃烤膜20min，68℃预杂交2～4h，68℃杂交过夜（16～20h）.洗膜、检测、显色.将病毒样品DNA杂交信号与阳性对照质粒DNA杂交信号相比较，确定重组病毒物理滴度.1．2．6重组病毒EGFP的活性检测取5×104/孔细胞接种于24孔细胞培养板，常规培养

7、24h后，取其中三孔消化、计数，取均数为每孔大致细胞数.据重组病毒滴度和细胞数/孔，按MOI梯度值（2×105，1×105，5×104）确定重组病毒加样量.阳性对照病毒为rAAV2EGFP（本元正阳基因技术有限公司提供，物理滴度为1×1015v.g./L），加样MOI值为1×105.2结果2．1重组质粒pSNAV2.0EGFPU6shRNA（VEGF165）构建及鉴定重组质粒pSNAV2.0EGFPU6shRNA（VEGF165）的结构见图1，该重组质粒通过PCR可扩出大小约500bp预期条带（图2），质粒构建正确

8、.图2pSNAV2.0EGFPU6shRNA（VEGF165）质粒PCR鉴定电泳图2．2重组病毒基因组中shRNA（VEGF165）的鉴定和SDSPAGE分析取病毒原液使用鉴定引物进行PCR鉴定显示同样可扩出大小约500bp的条带，表明靶向干扰VEGF1