eb病毒lmp1基因靶向shrna表达载体构建方法的比较研究论文

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1、EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究论文【关键词】疱疹病毒4型,人；RNA干扰；遗传载体parativestudybetethodsofshorthairpinRNAexpressionvectortargetingEpsteinBarrvirusLMP1gene【Abstract】AIM:ToexplorethedifferencesbetethodsofshorthairpinRNAexpressionvectortargetingEpsteinBarrvirus(EBV)latentmembrane

2、protein1(pshLMP1),soastolookforamorestableandconvenientethodorPCRmethod,andthedifferencesofconstructivestrategies,constructionprocessesandsequencingresultsbetethodsethodsbutbettercloningefficiencyethodutation.CONCLUSION:PCRmethodisamoreefficientorestablepshLMP1expres

3、sionvector.【Keyan;RNAinterference;geicvectors【摘要】目的：探讨两种构建EB病毒LMP1基因的shRNA表达载体(pshLMP1)方法的不同，寻找更加稳定方便的靶向shRNA表达载体的构建方式.方法：设计针对EB病毒LMP1基因的特异siRNA编码序列，分别应用传统的双链退火法和新颖的双链PCR法构建pshLMP1，比较两种方法在设计原则、构建方法和鉴定结果上的不同.结果：两种方法均能得到pshLMP1重组质粒，但是双链PCR法构建效率高且不易引起碱基的缺失和突变.结论：双链PCR法构

4、建EB病毒pshLMP1表达载体比传统双链退火法更加稳定，构建成功率较双链退火法高.【关键词】疱疹病毒4型，人；RNA干扰；遗传载体0引言应用RNA干扰技术阻断EpsteinBarr病毒LMP1基因(EBVLMP1)的表达已成为鼻咽癌基因治疗的研究方向之一.常用的RNA干扰表达载体构建方法为双链退火法，但是由于DNA寡核苷酸单链片段长度在60~70bp左右.freelRNA和cDNA序列从GenBank搜索.pTZU6+1载体由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室保存提供，内含有人U6启动子，能在体内转录产生RNA链，含X

5、baI和SalI克隆位点.DNA寡核苷酸链由上海英骏生物技术有限公司合成.TaqDNA聚合酶，dNTPs及相应buffer,限制性内切酶SalI,XbaI及相应buffer，T4连接酶均购自Takara公司.其余试剂均为自行配制.DNA测序工作由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室完成.1.2方法1.2.1选择EBVLMP1基因靶位点EBVLMP1cDNA序列由exona,b,c三个外显子组成.在exonc中第747920位碱基中有多个内部重复序列，长度为35bp：GTCCTGGGACTGTTGTGACTACTGTTACC

6、GGGTGT.根据siRNA设计原则，选择该重复序列中第323位的21个碱基为靶位点，设计EBVLMP1基因靶向RNA干扰表达载体(pshLMP1).1.2.2双链退火法构建pshLMP11.2.2.1按照图1的策略构建合成DNA寡核苷酸单链其中21ntcodingsequence为拟沉默的EBVLMP1靶基因序列.图1双链退火法构建pshLMP1策略（略）1.2.2.2退火，构建、鉴定pshLMP1重组质粒取等量100mmol/L的DNA寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液（100mmol/LNaCl）中95℃加热5min，缓慢

7、降至室温，乙醇沉淀法纯化DNA双链，25g/L琼脂糖电泳鉴定.双链DNA片段与用SalI和XbaI双酶切的转录载体pTZU6+1进行连接，转化大肠埃希杆菌JM109，Amp抗性筛选，阳性克隆进行菌液PCR鉴定，并测序鉴定插入序列正确与否.1.2.3双链PCR法构建pshLMP11.2.3.1按照图2的策略构建合成EBVLMP1PCR引物其中两条引物间3′端以10个碱基互补配对（pairingbases）为佳，21ntcodingsequence为拟沉默的EBVLMP1靶基因序列.图2双链PCR法构建pshLMP1策略（略）1.2

8、.3.2双链PCR法扩增，纯化，鉴定以合成的寡核苷酸链同时为模板和引物，进行PCR扩增，反应体系如下：10×Taqbuffer2.5μL,Mgcl2(25mmol/L)2μL,dNTPs(2.5mmol/Leach)2μL，上下游引物(20μmol/L)各9μL