eb病毒lmp1基因靶向shrna表达载体构建方法的比较研究(1)

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1、EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究(1)　　【关键词】疱疹病毒4型,人；RNA干扰；遗传载体　　ComparativestudybetweentwoconstructionmethodsofshorthairpinRNAexpressionvectortargetingEpsteinBarrvirusLMP1gene　　【Abstract】AIM:ToexplorethedifferencesbetweentwoconstructionmethodsofshorthairpinRNAexpressionvectortargetingEpsteinBarr

2、viruslatentmembraneprotein1,soastolookforamorestableandconvenientwayofconstructingthespecialshRNAvector.METHODS:ThesiRNAcodingsequencestargetingEBVLMP1weredesigned;pshLMP1expressionvectorwasachievedbytheconventionalannealingmethod or PCRmethod,andthedifferencesofconstructivestrategies,constru

3、ctionprocessesandsequencingresultsbetweenthetwomethodswereanalyzed.RESULTS:pshLMP1expressionvectorwasobtainedbybothmethodsbutbettercloningefficiencywasachievedbyPCRmethodwithrarebasedeletionandmutation.CONCLUSION:PCRmethodisamoreefficientwaytoconstructthemorestablepshLMP1expressionvector.　　【K

4、eywords】herpesvirus4,human;RNAinterference;geneticvectors　　【摘要】目的：探讨两种构建EB病毒LMP1基因的shRNA表达载体方法的不同，寻找更加稳定方便的靶向shRNA表达载体的构建方式.方法：设计针对EB病毒LMP1基因的特异siRNA编码序列，分别应用传统的双链退火法和新颖的双链PCR法构建pshLMP1，比较两种方法在设计原则、构建方法和鉴定结果上的不同.结果：两种方法均能得到pshLMP1重组质粒，但是双链PCR法构建效率高且不易引起碱基的缺失和突变.结论：双链PCR法构建EB病毒pshLMP1表达载体比传统双链

5、退火法更加稳定，构建成功率较双链退火法高.　　【关键词】疱疹病毒4型，人；RNA干扰；遗传载体　　　　0引言　　应用RNA干扰技术阻断EpsteinBarr病毒LMP1基因的表达已成为鼻咽癌基因治疗的研究方向之一.常用的RNA干扰表达载体构建方法为双链退火法，但是由于DNA寡核苷酸单链片段长度在60~70bp左右，化学合成的错误率高，为EBV-LMP1基因的RNA干扰载体（pshLMP1）构建带来了不便.因此我们设计了双链PCR法构建pshLMP1，经过实践证实双链PCR法提高了构建成功率，能够加速RNA干扰技术在鼻咽肿瘤的研究进度.　　　　1材料和方法　　材料EBVLMP1mR

6、NA和cDNA序列从GenBank搜索.pTZU61载体由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室保存提供，内含有人U6启动子，能在体内转录产生RNA链，含XbaI和SalI克隆位点.DNA寡核苷酸链由上海英骏生物技术有限公司合成.TaqDNA聚合酶，dNTPs及相应buffer,限制性内切酶SalI,XbaI及相应buffer，T4连接酶均购自Takara公司.其余试剂均为自行配制.DNA测序工作由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室完成.　　方法　　选择EBVLMP1基因靶位点EBVLMP1cDNA序列由exona,b,c三个外显子组成.在exonc中第747920位

7、碱基中有多个内部重复序列，长度为35bp：GTCCTGGGACTGTTGTGACTACTGTTACCGGGTGT.根据siRNA设计原则，选择该重复序列中第323位的21个碱基为靶位点，设计EBVLMP1基因靶向RNA干扰表达载体.　　双链退火法构建pshLMP1　　按照图1的策略构建合成DNA寡核苷酸单链其中21ntcodingsequence为拟沉默的EBVLMP1靶基因序列.　　图1双链退火法构建pshLMP1策略（略）　　退火，构建、鉴定pshLMP1重组质粒取等量100