靶向xt1基因shrna真核表达质粒载体的构建及筛选

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1、万方数据靶向XT．1基因shRNA真核表达质粒载体的构建及筛选余资江1。余德立2(1贵阳医学院，贵州贵阳550004；2贵阳中医学院第二附属医院)[摘要]目的构建靶向木糖转移酶-1(XT一1)的短发卡状小干扰RNA(shRNA)质粒表达载体；为寻找脊髓损伤治疗的新靶点提供工具。方法设计4个小分子短发卡状RNA(siRNA)序列，体外合成DNA模板引物，与Pgenesil-l质粒构建成编码shRNAR的表达载体，进行酶切和测序，再转染体外培养的星形胶质细胞，筛选靶序列。结果构建的质粒表达载体完全符合设

2、计要求，转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光，G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码XT-1．shRNA的质粒表达载体；该载体为寻找脊髓损伤治疗的新靶点奠定了基础。[关键词】硫酸软骨素蛋白多糖；木糖转移酶．1；小分子干扰RNA；短发卡状RNA；质粒载体[中图分类号]R322．81[文献标识码]A【文章编号]1002．266X(2009)03-0019-03EstablishandselectionofplasmidexpressivevectorcodingshRNAtargetingX

3、T-1YUZi-jian91．YUDe．1i(1CuiyangMedicalCollege，Cuiyang550004，只R．China)Abstract：ObjictiveToestablishandselecttheplasmidexpressivevectorcodingshorthairpinRiga(shRNA)tar-getingxylosyltransferase·1(XT-I)，inordertofindanewtherapeutictargetforthetreatmentofsp

4、inalcordinjury．Meth·odsFoursequencesofsmallinterferenceRNA(siRNA)weredesigned．DNAtemplateprimerofXT-1惴synthesizedinvitroandtheplasmidexpressivevectorscodingshRNAwereestabhshedwithpGenesil一1plasmid，thenwereidentifiedbydigestionandtestedforthesequence．Th

5、eastrocyeesweretransfeetedwithplasmidvictor，andthenweretakenfluores-cencephotographsandselectedbyG418．ResultsThedigestionidentificationofphsmidvectorsconfirmedthatDNAtern·plateprimerWtagsuceessfullyinsertedintheplasmidandthesequenceWaSinconformitywitht

6、hedesignedresult．Aftertheplasmidw=etorwithglx把nfluorescentproteinW88transfectedtothecells．itwasseen∞agreenfluorescentwave．Theposi-tirecloneswerealsosuccessfullyselected．ConclusionPlasmidexpressivevectorscedingXT-1shRNAcallbeSUCC@SS-fullyestablishedandc

7、apableofstabletransfeetion，andwhichprovidedanewtherapeuticfoundationforthetreatmentofspinalcordinjury．Keywords：ehondroitinsulphateproteoglycans；xylosyltransferase-1；8mallinterferenceRNA；shorthairpinRNA；plasmidexpressive脊髓损伤是常见的危重疾病，胶质瘢痕在脊髓损伤后形成并逐渐加剧，是抑

8、制脊髓修复的关键因素之一⋯。硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)是胶质瘢痕内重要抑制成分，由糖胺聚糖(GAG)链与不同核心蛋白共价结合形成，包括Phosphacan、Neuroean、brevican、NG2及aggrecan等【2J。脊髓损伤不同时期，胶质瘢痕内细胞成分及CSPGs水平不同最终构成胶质瘢痕的主要成分∞1。研究表明，木糖转移酶(XT．1)是合成CSPGs中GAG的关键酶，GAG合成的起始步骤是在XT．1催化下，将一分子木糖基连接到核心蛋白多肽链的丝氨酸残基