靶向抑制人木糖基转移酶ⅰ基因的shrna真核表达载体的构建

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1、万方数据华西口腔医学杂志第26卷第2期2008年4月WestChinaJournalofStomatologyV01．26No．2Apr．2008【文章编号】1000—1182(2008)02-0206-05靶向抑制人木糖基转移酶一I基因EtCJshRNA真核表达载体的构建石宏，王洁，王旭，顾洪涛，侯亚丽，于利洁(河北医科大学口腔医院病理科，河北石家庄050017)【摘要】目的构建靶向抑制人木糖基转移酶一I(XT—I)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体，为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖(PG)的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT—I基因序列，设计

2、短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆至lJPgenesil一1载体中，构建shRNA真核表达载体WJl一WJ6，行酶切及核酸测序鉴定；将构建的x’r-I特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC—M，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，流式细胞术检测转染效率，并采用半定量RT—PCR和Westernblot分别检测转染后细胞XT—I基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJl、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实，构建的shRNA表达载体WJl一WJ6序列正确；转染WJl一W

3、J6后ACC—M细胞均可表达绿色荧光；流式细胞术测定转染效率平均为50．26％；RT—PCR结果显示，WJ3显著抑gljXT-ImRNA的表达，抑制率为72．39％；Westernblot结果显示，WJ3有效抑制xT—I的蛋白表达，抑制率为70．18％。结论成功构建靶向抑制XT—I的shRNA真核表达载体WJl一WJ6，其中WJ3可高效抑制XT—I基因mRNA及蛋白水平的表达，为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。【关键词】人木糖基转移酶一I；短发夹状shRNA；唾液腺肿瘤；肌上皮细胞；蛋白多糖【中图分类号】R739．87【文献标识码】AConstructionofeukary

4、oticexpressionvectorofshorthairpinRNAtargetinghumanxyiosyltransferase-IgeneSHIHong,WANG№，WANGXu,GUHong-tao,HOUYa-li,YULij论、(Dept．ofOralPathology,CollegeofStomatology,HebeiMedicalUniversity,Sh扩iazhuang050017，China)[Abstract]ObjectiveTodesignandconstructtheplasmidsexpressingshorthairpinRNA(shRNA)

5、targetinghumanxylosyltransferase-Io【’r-I)whichistheinitiatingenzymeinthebiosynthesisofproteoglycans(PG)．MethodsShortchainoligonucleotidesweredesignedaccordingtothesequenceofXT—IprovidedbyGenBank．TheDNAsegmentsweregainedthroughannealingafterchemosynthesis．andwereclonedintoPgenesil-1vector．Therec

6、ombinantXT—IshRNAexpressionvectorswereidentifiedbydigestionandsequencinganalysis．AtlasttheconstructedXT—Iex-pressionvectorsweretransfectedintosalivaryadenoidcysticcarcinomacellline(ACC—M)byLipofectomineTM2000．Theexpressionofgreenfluorescentprotein(GFP)Wasdetectedbyinvertedfluorescentmicroscopea

7、ndtheratesoftransfectionwelt七detectedbyflowcytometer．SemiquantitativeRT-PCRwasusedtodetecttheexpressionofmRNAlevelofXT—IintransfectedACC—McellsandtheproteinexpressionofXT—IWS．8detectedbyWesternblot．ResultsTheplasmidsexpressingshRN