乙酰肝素酶shrna双基因共表达真核载体的构建和筛选

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1、乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选作者：刘玉，辛晓燕，毛敬，张潍【关键词】乙酰肝素酶ConstructionandidentificationofeukaryoticexpressionvectorexpressingdoubleshRNAsectionstargetingheparanasegene　　【Abstract】AIM:ToconstructandidentifyeukaryoticexpressionvectorexpressingdoubleshRNAsectionstargetingheparanasegene

2、(HpashRNA).METHODS:Sixpairsofoligonucleotidesicallysynthesized.AfterrandomlyconnectinganoligonucleotideandanotheroneidpGenesil1oterandterminationcode,themongreenfluorescenceprotEin(EGFP)geneandNeogene.Inthisetryandfluorescencemicroscope.TheinhibitioneffectivenessofHpaprotEInm

3、unohistochemicalstaining.RESULTS:TheconstructedeukaryoticexpressionvectorseffectivelysuppressedtheHpaexpressionintransfectedcells.The3vectorsofdifferentshorthairpinRNAofHpaeffectivelysuppressedtheexpressioninSKOV3（P<0.01）.CONCLUSION:ETAFECTENE转染试剂（德国Biontex公司）；dsDNA片段（武汉晶赛

4、生物工程公司化学合成）；山羊抗人Hpa多克隆抗体（SantaCruz公司）；SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂（棕色）（武汉博士德公司）.　　1.2方法　　1.2.1发卡样Hpa基因（HpashRNA）设计根据GenBank提供的Hpa基因cDNA序列,通过基因Blast验证,挑选6条长各为21个碱基的特异性寡核苷酸序列5′GTACTTGCGGTTACCCTAT３′;5′GCTTCGTACCTTGGCCAGA３′;5′TTGCTACTCCGAGAACACT３′;5′TGGGTCGCAGTTAGGAGAA３′;5′GGAAGCTTCGAGTATA

5、CCT３′;5′GCTTCGAGTATACCTTCAT３′.分别在5′和3′端引入BamHI和HindIII酶切位点,按如下结构BamHI+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SacI/EcoRI/SacI/SalI/SalI/XbaI+HindIII化学合成有发卡样结构的shRNA寡核苷酸单链,同时合成互补链.1.2.2pGenesil1HpashRNA的构建用50μLannealingbuffer溶解上述单链目的基因片段.各取2μL单链+16μLannealingbuffer，94℃退火自然冷却至室温.用双链退火连接后再磷酸化

6、的退火片段分别与线性化Pgenesil1载体连接，22℃水浴反应过夜,构建的阳性克隆命名为pGenesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）,pGenesil1HpashRNA（3）.　　1.2.3pGenesil1HpashRNA扩增及纯化各取5μL连接产物转化感受态细胞DH5а，涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜.各挑取3个单克隆菌落接种于3mL含Kanar抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜.收集菌液,小量快速抽提质粒DNA,15g/L琼脂糖凝胶电泳，部分菌液送上海申友公司测序

7、.　　1.2.4细胞转染及表达鉴定提取3种重组质粒，并进行DNA定量.SKOV3细胞生长到占瓶底约80%～90%时，分为pGenesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）,pGenesil1HpashRNA（3）及非特异性shRNA片段对照4组，按照METAFECTENE转染试剂盒操作方法转染，以含800mg/LG418的RPMI1640培养液培养4,接收光为530nm.用Cellquest软件进行数据获取与分析.　　1.2.6免疫组化染色检验细胞Hpa蛋白表达细胞爬片，乙醇固定，按SABC方法染色.胞质中出现棕黄

8、色颗粒为阳性，每张切片在400倍显微镜下随机计数300个细胞.阴性（－）：不着色；阳性（+）：细胞质内有细小稀疏黄色颗粒；（）：细胞质内