人乙酰肝素酶基因增强子的初步筛选与鉴定-论文.pdf

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1、东JS南out大hea学st学Un报ivf(M医e学dS版ciEdi)2。13，’。ct；’32(、5)一：543‘548·543·人乙酰肝素酶基因增强子的初步筛选与鉴定陈晓鹏，杨来志，葛国朝，崔巍，屠佳，田野(皖南医学院弋矶山医院肝胆一科，安徽芜湖241001)[摘要]目的：初步筛选并鉴定出人乙酰肝素酶(HPSE)基因内具有增强子(enhancer，enh)活性的DNA片段。方法：增加nI、SalI酶切位点，将含有报告基因增强型绿色荧光蛋白(pEGFP)质粒载体pEGFP—N1改造为pEGFPMU。选取HPSE基因5端启动子上、下游的DNA序列并分为lO个片段，分别命名为

2、enhx(x分别等于1、2、3⋯⋯10)，每段长1200bp，相邻两段间重复200bp。分别扩增上述10个片段和猿猴病毒4O(SV40)增强子序列，分别插入pEGFP—MU，以构建重组质粒pEGFP。MU。enhx和pEGFP。MU。SV40e，并用脂质体2000转染肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC一7901，荧光显微镜和流式细胞仪分析上述候选序列对启动子(CMV)转录活性的影响。结果：琼脂糖凝胶电泳和DNA测序结果显示，PCR克隆序列与GeneBank中序列完全一致。酶切电泳和测序结果显示，重组质粒pEGFP‘MU。enhx和pEGFP-MU。SV40e构建符合要

3、求。瞬时细胞转染、荧光显微镜和流式细胞仪分析发现，重组质粒pEGFP—MU‘enh6、pEGFP-MU—enh7和pEGFP-MU-enh8在人BEL一7402、SGC一7901细胞中表达增强，与阳性对照质粒pEGFP—MU—sv40e相似，其余重组质粒表达较弱。结论：成功克隆人HPSE基因10个增强子候选序列片段，并正确构建重组质粒pEGFP—MU—enhx；其中第6、7和8候选片段可能具有增强子活性。本研究为后续进一步筛选和鉴定有活性的增强子序列缩小了搜寻范围，并为将来利用HPSE增强子进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。[关键词]乙酰肝素酶；增强子；启动子；肿瘤；质粒[中

4、图分类号]R34[文献标识码]A[文章编号]16716264(2013)05。0543—06doi：10．3969／j．issn．1671—6264．2013．05．003PreliminaryscreeningandidentificationofenhancerfragmentofhumanheparanasegeneCHENXiao’peng，YANGLai。zhi，GEGuo。chao，CUIWei，TUJia，TIANYe(DepartmentofHepatobiliaryDivisionOne，Y~hanHospital，WannanMedicalCollege

5、，Wuhu241001，China)[Abstract]Objective：ToscreenpreliminarilytheDNAfragmentwithenhancer(enh)activityinhumanheparanase(HPSE)gene．Methods：PlasmidvectorpEGFP。N1wasreformedintopEGFP’MUbyaddingtherest。fictionenzymecuttingsitenIandSalIinitsDNAsequence．TheDNAsequencesintheupstreamanddownstreamofhum

6、anHPSEgenepromotorwereselectedanddividedinto10fragments，namedenhx(x=1，2，[收稿日期]2013。02—08[修回日期]2013—04。17[基金项目]安徽省自然科学基金课题资助项目(11040606M181)；安徽省高校省级自然科学基金资助项目(kj2010B239)[作者简介]陈晓鹏(1967一)，男，安徽枞阳人，主任医师，医学博士，教授。E。mail：drcxp@sohu．com[通信作者]陈晓鹏E—mail：drcxp@sohu．corn[引文格式]陈晓鹏，杨来志，葛国朝，等．人乙酰肝素酶基因增强子

7、的初步筛选与鉴定[J]．东南大学学报：医学版，2013，32(5)：543。548·544·东南大学学报(医学版)2013年10月，32(5)3，⋯10)．Everyfragmentwas1200bplong，and200bpwasrepeatedbetweentwoadjacentfragments．Above10fragmentsandtheenhancersequenceofsimianvirus40(SV40)wereamplifiedandinsertedintotheplasmidpEGFP’MUtoc