肾癌乙酰肝素酶基因和蛋白表达的研究.doc

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肾癌乙酰肝素酶基因和蛋白表达的研究作者：涂响安，丘少鹏，邓春华，吕自力，胡斌，郑克立【摘要】目的实验证明乙酰肝素酶在多种恶性肿瘤中有高表达，并可能在恶性肿瘤细胞侵袭及转移中发挥重要作用。本研究探讨肾癌乙酰肝素酶基因和蛋白表达水平及其与肾癌发生、发展和转移的关系。方法应用荧光定量逆转录聚合酶链式反应和免疫组化Envision二步法分别检测30例新鲜肾癌和癌旁正常组织中乙酰肝素酶mRNA的表达水平及62例石蜡包埋肾癌组织中乙酰肝素酶蛋白的表达水平。结果乙酰肝素酶mRNA在肾癌中阳性表达11例(36.7%)，乙酰肝素酶蛋白在肾癌中阳性表达15例(24.2%)，其表达率与肿瘤的病理分级、临床分期和淋巴结转移有相关性(P<0.05)。结论乙酰肝素酶基因和蛋白的异常表达可作为肾癌发生和发展的预后参数。【关键词】肾肿瘤；乙酰肝素酶；免疫组化；荧光定量PCRStudyofheparanasegeneandproteinexpressioninrenalcellcarcinomaABSTRACT:ObjectiveHeparanaseisoverexpressedinmanymalignanttumorcells,itmayplayapivotalroleininvasionandmetastasisofmalignanttumors.Thestudyistodeterminetheexpressionofheparanasegeneandproteininrenalcellcarcinomaandtherelationshipwithitsdevelopment,progressionandmetastasis.MethodsFluorescencequantitativeRTPCRwasusedtodetecttheexpressionofheparanasemRNAin30casesoffreshrenalcellcarcinomaandadjacentnormaltissues.Immunohistochemicaltechniquewasusedtodetecttheexpressionofheparanaseproteinin62casesofparaffinembeddedrenalcellcarcinomatissues.ResultsThepositiveexpressionsofheparanasemRNAandproteinwere36.7%(11/30)and24.2%(15/62),respectively.TheheperanasemRNAandproteinexpressionwerecorrelatedwiththepathologicaltype,clinicalstageandlymphnodemetastasis(P<0.05).ConclusionHeparanasegeneandproteinoverexpressionmightserveasamarkerfortheprognosisofrenalcellcarcinoma.KEYWORDS:kidneyneoplasms;heparanase;immunohistochemicaltechnique;fluorescencequantitativePCR细胞外基质和基底膜是肿瘤细胞侵袭及转移的屏障。糖氨聚糖是屏障的主要成分之一，主要成分为硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycan,HSPG)。乙酰肝素酶(heparanase,4 Hpa)正是一种裂解糖氨聚糖中HS链的内切糖苷酶，在细胞侵袭中起着极其重要的作用。最近,随着Hpa基因得以克隆，Hpa在侵袭性细胞穿越血管壁，实现浸润、扩散、转移过程中的关键作用受到广泛关注[1]。我们应用荧光定量逆转录聚合酶链式反应和免疫组化Envision二步法分别检测30例新鲜肾癌和癌旁正常组织中乙酰肝素酶mRNA的表达水平及62例石蜡包埋肾癌组织中乙酰肝素酶蛋白的表达水平，探讨肾癌乙酰肝素酶基因和蛋白的表达水平及其与肾癌发生、发展和转移的关系。1资料与方法1.1临床资料收集中山大学第一附属医院泌尿外科2001年11月-2003年12月手术切除肾癌石蜡包埋组织标本62例，男性45例，女性17例。年龄31-78岁，平均54.1岁。Fuhrman分级：G118例，G230例，G314例。UICC临床分期：T126例，T220例，T316例。淋巴结转移阳性23例，阴性39例。10例正常肾脏组织为对照。另收集2002年1月-2003年12月手术切除新鲜肾癌标本和癌旁正常组织30例，男性21例，女性9例。年龄42-67岁，平均54.7岁。Fuhrman分级：G19例，G214例，G37例。UICC临床分期：T112例，T210例，T38例。淋巴结转移阳性11例，阴性19例。1.2荧光定量逆转录聚合酶链式反应1.2.1肝素酶引物序列和探针heparaF：5′TCACCATTGACGCCAACCT3′；R：5′CTTTGGAGAACCCAGGAGGAT3′；Probe：5′FAMCCACGGACCCGCGGTTCCTAMRA3′(中山大学达安基因诊断中心合成)。1.2.2组织RNA的提取组织块约100mg置匀浆器，加Trizo12mL，进行匀浆、分层、浓缩、沉淀、洗涤和溶解，每份样品在紫外分光光度计上测定在260nm至280nm吸光度值，计算RNA的提取率和纯度。1.2.3逆转录反应取2μLRNA模板做逆转录反应。反应体系：5×逆转录buffer2μL，下游引物0.5μL，dNTPs1μL，MMLV1μL，DEPC水3.5μL，RNA模板2μL，总体积10μL。反应条件：37℃1h，然后95℃3min。1.2.4荧光定量PCR阳性定量标准品及样本均按以下反应体系进行：5×定量PCRbuffer10μL，上游引物F1μL，下游引物R1μL，dNTPs1μL，荧光探针1μL，Taq酶2μL，cDNA5μL，ddH2O29μL。反应条件：93℃2min，然后93℃2min，55℃1min，共40个循环。反应结束后，由PE7000全自动荧光定量PCR仪自动分析并计算结果。1.3免疫组织化学染色鼠抗人乙酰肝素酶单克隆抗体购自武汉博士德公司，Envision二抗为DAKO公司产品，二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购自福州迈新公司。免疫组织化学染色采用Envision二步法，实验步骤按试剂盒说明书进行。乙酰肝素酶一抗工作浓度为1∶50，采用微波煮沸15min修复抗原，抗原修复液为0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)。一抗4℃孵育过夜，PBS洗3次，Envision二抗室温孵育40min，PBS洗3次后DAB显色3-5min4 ，自来水终止显色，充分水洗后苏木精复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。以阳性切片做阳性对照，阴性对照以PBS替代第一抗体。结果判断：乙酰肝素酶阳性信号为细胞浆内呈现棕黄色颗粒。(-)：阳性细胞数<10%；(+)：阳性细胞数10%-50%；()：阳性细胞数>50%。1.4统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件，χ2检验和非参数检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1乙酰肝素酶mRNA在肾癌和癌旁正常组织中的表达乙酰肝素酶mRNA在肾癌中的阳性表达率为36.7%(11/30)，表达量为2843187.5copy/μgRNA，其表达率和表达量均明显高于癌旁正常组织(P<0.05)；乙酰肝素酶mRNA阳性表达率和表达量与肿瘤的病理分级、临床分期和淋巴结转移有相关性(P<0.05，表1)。表1乙酰肝素酶mRNA在肾癌和癌旁正常组织中的表达与癌旁正常组织比较，*P<0.05，**P<0.05；与相应的G1、T1、无淋巴结转移相比较，△P<0.05,△△P<0.012.2免疫组织化学染色乙酰肝素酶蛋白在肾癌阳性表达率为24.2%(15/62)，其阳性颗粒定位于癌细胞浆内(图1)。G1、G2和G3期肿瘤中其阳性表达分别为1例(5.6%)、3例(10%)和11例(78.6%)；T1、T2和T3期肿瘤中其阳性表达分别为1例(3.8%)、2例(10%)和12例(62.5%)；淋巴结转移阳性和阴性肿瘤中其阳性表达分别为14例(60.9%)和1例(2.6%)；乙酰肝素酶蛋白阳性表达率与肿瘤的病理分级、临床分期和淋巴结转移有相关性(P<0.01，表2)。10例正常肾脏组织1例为阳性表达，阳性颗粒位于正常肾小管上皮细胞浆内。3讨论恶性肿瘤的主要特点是浸润和扩散，该过程主要包括：细胞与细胞及细胞与细胞外基质黏附降低，瘤细胞穿过细胞外基质，甚至穿过基底膜到达血管、淋巴管或周围组织。在这个过程中，黏附因子起重要的作用。肾癌是泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤，容易扩散和转移。肾癌的扩散和转移是一较为复杂的过程，涉及多基因、多阶段的作用，一直是众多学者研究的热点，目前认为细胞与细胞及细胞与基质间黏附性降低以及诱导血管形成是肿瘤浸润和转移的关键环节。乙酰肝素酶基因是一种新近被克隆出来的基因，它编码的蛋白质被认为是一种降解HSPG的HS侧链的核苷内切酶。人类乙酰肝素酶基因位于人的染色体4q21.3，该基因可以表达为5kb(HPSE1a)和1.7kb(HPSE1b)mRNA两种类型。HPSE1a包含14个外显子和13个内含子；而HPSE1b的第1个和第14个外显子已经被叠接在外。国内外有关乙酰肝素酶在肿瘤中作用的研究，初步显示乙酰肝素酶具有促进肿瘤转移和肿瘤血管形成的作用，并可能成为肿瘤治疗的一个新靶点[24 3]。Gohji等[4]应用免疫组化和原位杂交的方法在膀胱癌中的研究发现乙酰化肝素酶蛋白和基因表达与膀胱癌浸润和扩散密切相关。Stadlmann等[5]应用一步PCR和原位杂交的方法在前列腺癌中的研究发现乙酰肝素酶基因表达随肿瘤的病理分级和临床分期的上升而下降。我们应用荧光定量逆转录聚合酶链式反应和免疫组化的方法对肾癌的研究亦证实乙酰肝素酶基因和蛋白的表达率与肿瘤的病理分级、临床分期和淋巴结转移有相关性，乙酰肝素酶基因和蛋白的异常表达可作为肾癌发生和发展的预后参数。【参考文献】[1]VlodavskyI,FriedmannY,ElkinM,etal.Mammalianheparanase:genecloning,expressionandfunctionintumorprogressionandmetastasis[J].NatMed,1999,5(7):793802.[2]VlodavskyI,GoldshmidtO,ZchariaE,etal.Mammalianheparanase:involvementincancermetastasis,angiogenesisandnormaldevelopment[J].SeminCancerBiol，2002,12(2):121129.[3]HulettMD,FreemanC,HamdorfBJ,etal.Cloningofmammalianheparanase,animportantenzymeintumorinvasionandmetastasis[J].NatMed,1999,5(7):803809.[4]GohjiK,OkamotoM,KitazawaSI,etal.Heparanaseproteinandgeneexpressioninbladdercancer[J].JUrol,2001,166(4):12861290.[5]StadlmannS,MoserPL,PollheimerJ,etal.Heparanase1geneexpressioninnormal,hyperplasticandneoplastictissue[J].EurJCancer,2003,39(15):22292233.4