环氧化酶－２基因和蛋白在人肾癌组织中的表达

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1、环氧化酶－２基因和蛋白在人肾癌组织中的表达作者：夏艳飞　阳冬芳　李海军　曾令斌【摘要】目的探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因和蛋白在肾癌组织中的表达及与其分型之间的关系。方法收集经手术病理证实肾癌组织的标本39例和正常肾组织8例,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及RNA及蛋白的表达水平。结果肾癌组织中的COX-2的基因和蛋白的表达明显高于正常肾组织组(P<0.01)；在三种类型的肾癌中，混合型肾癌组织中COX-2表达最强，颗粒细胞癌的表达水平次之，肾透明细胞癌中表达最少(P<0.01)。结论COX-2的基因和蛋白的表达在肾癌组织中

2、增高且与其病理分型密切相关。　　【关键词】肾癌；环氧化酶-2；基因；蛋白质　　　　环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是前列腺素合成过程中的重要限速酶,它在某些肿瘤组织中高表达,可能参与肿瘤的发生与发展。肾癌是一种常见的泌尿系统肿瘤,发生率仅次于膀胱癌。本研究采用以外的正常肾脏组织8例为对照,经病理检查无癌细胞浸润。　　1.2主要试剂ReverseTranscriptionSystem购自美国Promega公司；COX-2及GAPDH上、下游引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其他试剂均为国产试剂。　　1.3逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肾

3、癌组织COX-2mRNA的表达用TRIzol试剂提取细胞总RNA，溶于无Rnase水中，紫外分光光度计测定OD260/OD280的比值在118~210。取总RNA2μg，用Promega公司逆转录试剂盒合成cDNA，再取逆转录产物110μl进行PCR循环。内参照采用GAPGH，引物序列为:上游5′-AACTTTGGCATTGTG2GAAGG-3′，下游5′-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3′，扩增片段长度为599bp。COX-2引物序列：上游5′-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3′,下游5′-AGATCATCTCTGGCCTGAGTATCTTT-3

4、′,扩增片断长度305bp。PCR反应条件：95℃温育3min，94℃变性45s，60℃复性40s，72℃延伸30s，30个循环，末次循环72℃延伸10min。反应结束后，取RT-PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，加样量均为5μl，溴化乙锭染色。电泳条带采用UVP型凝胶图像分析系统做积分吸光度测定和分析，以各组目的基因与内参照基因的RT-PCR扩增DNA片段的吸光度值减去背景值的比值来比较待测基因的mRNA表达差异。　　1.4A1h）至PDVF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2h后，按1∶1000比例加入兔抗人COX-1一抗，于室温孵育1h；TBST洗涤3次，每次5min；按1∶100

5、0比例加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育1h；TBST洗3次，每次5min；然后用RNA的表达RT-PCR分别检测肾癌组织及正常肾组织COX-2mRNA的表达水平，结果发现，在正常肾组织中，COX-2的基因表达很少，大部分呈阴性表达。而肾癌组织中其表达明显增加，且三种类型的肾癌中，混合型肾癌组织中表达最强，肾透明细胞癌中表达最少，而颗粒细胞癌的表达水平居中（结果如图1）。　　　　2.2肾癌组织及正常肾组织中COX-2蛋白的表达Western免疫印迹法分别检测肾癌组织及正常肾组织COX-2蛋白质的表达水平，结果发现，在正常肾组织中，COX-2蛋白表达较少，而肾癌组织中其表达明显

6、增加，其中混合型肾癌织中表达最强，颗粒细胞癌的表达水平次之，肾透明细胞癌中表达最少（结果如图2）。　　3讨论　　　　肾癌是肾脏最常见的恶性肿瘤,发病率约占肾恶性肿瘤的80%,占全身恶性肿瘤的3%。其生物学行为多变，发病机制以及发生、发展的分子生物学基础及预后仍不清楚。近年来，有研究发现犬科动物肾细胞癌模型体内COX-2具有高表达，并在肿瘤细胞增长调节方面起重要作用，COX-2与肾盂移行细胞癌的分型和分期的具有相关性，而COX-2选择性抑制剂可用于防治肾细胞癌［1-3］。　　环氧化酶是花生四烯酸合成前列腺素(prostaglandin,PG)的一个限速酶，可将花生四烯酸转变为各种PG产物

7、，维持机体的各种病理生理过程。目前发现哺乳动物COX至少有2种同工酶，即COX-1和COX-2，其中COX-2为诱导性表达，静息时并不表达，在大多数正常组织难以发现，一般只在受刺激时迅速合成，这种刺激因子可为细胞因子、生长因子、促癌剂以及癌基因产物等。COX-2在致癌作用中充当重要角色，研究发现它在人体结肠癌、直肠癌、胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、喉癌等组织中检测到COX-2的高表达［4］。罗洪波等通过免疫组化研究认为，肾细胞癌中COX-2的高