乙酰肝素酶基因表达增强大肠癌转化细胞侵袭能力的实验研究

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　　乙酰肝素酶基因表达增强大肠癌转化细胞侵袭能力的实验研究【关键词】乙酰肝素酶　　TheEnhancedEffectofHeparanaseGeneExpressionontheInvasiveAbilityofColorectalCancerTransformedCell　　Abstract：ObjectiveThisstudyancolorectalcancercelllinesHT29.Thecellgrober.Tumorigencityandorthotopicimplantationofhistologicallyintacttumorinnudemice'sileocecaljunctionindicatedtheinvasiveabilityofcolorectalcancertransformedcellbytheexogenousexpressionofheparanasegene.ResultsAfterbEingtransfectedbertestongthreekindsofcells.Inthesametime,theentityneoplasmm×9mm×10mm）islargerthanthecontrolgroup（6mm×8mm×6mm）.Theincidencesofthelivermetastases（71.43%）ishigherthanthecontrolgroup（14.29%）.TherateoftumorigencityandmetastasisinnudemiceanexogenousheparanasegenecanfacilitatetoenhancethegroetastasisincelllineHT29.　　Key；Transfection；Metastasis　　摘要：目的探讨外源性乙酰肝素酶基因对增强大肠癌HT29细胞转移侵袭能力的影响。方法乙酰肝素酶(Heparanase，Hpa)基因真核表达载体转染大肠癌HT29细胞，观察转化细胞增殖和侵袭能力的变化，通过转化细胞裸鼠异种接种成瘤和实体瘤回盲部原位种植转移模型建立，观察乙酰肝素酶mRNA的表达对大肠癌HT29细胞侵袭性的影响。结果乙酰肝素酶基因转染细胞HT29Hpa较未转染细胞HT29和转染空载细胞HT29KZ生长速度明显加快；Boyden小室体外侵袭实验显示HT29Hpa细胞穿膜数（45.5±0.501）较HT29细胞（29.3±0.062）和HT29KZ细胞（30.1±0.247）增多，差异具有显著性(P<0.01)；转染细胞裸鼠皮下瘤生长速度明显加快；同期内HT29Hpa细胞形成的皮下瘤（12mm×9mm×10mm）较HT29细胞皮下瘤（6mm×8mm×6mm）大，HT29Hpa细胞皮下瘤回盲部原位种植致肝转移率（71.43%）较HT29细胞肝转移率（14.29%）增高。两者间差异有显著性意义(P<0.01)。结论乙酰肝素酶基因外源性的表达，能促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。　　关键词：乙酰肝素酶；大肠癌；转染；转移　　0引言 　　乙酰肝素酶（heparanase）是一种广泛存在于细胞外基质、密切参与肿瘤细胞生长和侵袭转移的葡萄糖醛酸酯酶，通过降解细胞外基质（extracellulermatrices，ECM）和基底膜（basementmembrane,BM）上起稳定作用的乙酰肝素（HeparanSulfateProteoglycans，HSPGs），破坏基质正常的结构，使肿瘤组织易于扩散和转移[1,2]。研究表明，在原位癌、微浸润癌和浸润癌中都出现不同程度乙酰肝素酶的表达和基底膜的崩解[2]，肿瘤细胞中乙酰肝素酶的表达量与肿瘤浸润的深度存在相关性[3]。HT29细胞源于人大肠癌组织，为低分化腺癌，体外培养生长缓慢，转移率低。本研究将自行设计和构建的乙酰肝素酶真核表达载体转染大肠癌HT29细胞，观察转化细胞生物学特性变化，探讨乙酰肝素酶mRNA的表达对肿瘤细胞侵袭、转移能力的影响。　　1材料和方法　　1.1主要试剂　　Trizol、DMEM、脂质体购自Gibco公司；MTT、G418购自Sigma公司；RTPCR试剂盒购自MBI公司；Matrigel凝胶及侵袭小室购自BD公司。　　乙酰肝素酶基因真核表达载体（pcDNA3Hpa）由本室构建，该重组质粒系由pcDNA3的EcoRⅠ位点间插入基因全长序列构成。地高辛加尾寡核苷酸标记盒，购自德国保灵曼公司。原位杂交试剂盒及免疫组化试剂盒，均购自武汉博士德公司。大肠癌细胞株HT29由第四军医大学消化病研究所保存；Balb/C（nu/nu）裸鼠购自中英合资上海西普－必凯实验动物有限公司，属T细胞缺乏型。　　1.2基因转染　　参照LipofectAMINE脂质体转染试剂盒标准程序进行pCDNA3Hpa重组质粒的大肠癌HT29细胞转染。转化细胞用含G418、浓度为800μg/ml的DMEN和10％新生小牛血清的完全培养液，37℃、5％CO2孵箱培养，4周后筛选出有G418抗性的转化细胞HT29Hpa和空载细胞HT29KZ。　　1.3细胞生长曲线　　分别以1×104个/ml细胞浓度接种HT29、HT29KZH和HT29Hpa细胞于96孔板，置孵箱，24h后每孔加20μlMTT（5mg/ml），4h后加二甲基亚枫100μl，室温振荡10min，置酶联免疫仪，测波长490nm吸光度值，每天计数每组细胞3孔，连续检测8d，绘制细胞生长曲线。 　　1.4原位杂交检测　　采用PrimerPremier5.0软件设计反义寡核苷酸链，共35个bp（5TTGCCTCATCACCACTTCTATTCCCATTCGGGCT3），由上海生物工程公司合成。取1pmol量，采用加尾寡核苷酸探针标记试剂盒，标记1μg加尾反义寡核苷酸探针，并进行标记效率检测。按敏感性加强型原位杂交试剂盒提供方法进行原位杂交检测。结果判定：以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，每张切片在400倍双目显微镜下随机计数300个细胞。阴性（－）：不着色；阳性（+）细胞胞浆内有细小稀疏黄色颗粒；（++）细胞胞浆内有较密的细小黄色颗粒；（+++）细胞内有明显的细小黄色颗粒。将结果按下面公式计算。　　细胞mRNA表达积分＝（+）%×1+（++）%×2+（+++）%×3　　1.5侵袭小室实验　　1mg/mlMatrigel凝胶铺于8μm孔径的微孔滤膜上，下室加入200μl趋化剂，1×104个/ml细胞悬液50μl加至上室，培养24h，擦去小室内层细胞，甲醛固定5min，HE染色，400倍光镜下计数膜背面穿膜细胞数，计数中间和四周5个视野，计算平均值，每组计数3份样本。　　1.6流式细胞仪检测　　1×105/ml的细胞悬液，用PBS洗涤2次，700ml/L冷乙醇固定，DAIP染色，上样于流式细胞仪进行细胞周期检测，计算各周期百分比。　　1.7回盲部原位接种至转移模型建立　　于一只Balb/C（nu/nu）雌性裸鼠背部右后肢皮下注入0.2mlHT29HP细胞(细胞数为1×107个/ml)；于背部左前肢皮下注入0.2mlHT29细胞(细胞数为1×107个/ml)，SPF中饲养4周，取出瘤体，剪成1.5mm大小的碎块。余14只裸鼠分两组，用0.3%苯巴比妥钠按40mg/kg剂量行腹腔麻醉，开腹暴露回盲部，于盲肠末端切开浆膜面，将肿瘤组织缝入浆膜切开处，关腹。手术过程遵循无菌原则。术后继续SPF条件下饲养。种植83d后将裸鼠颈椎脱位处死，记录200倍镜下肝、肺转移灶，计算转移率。转移率＝200倍镜下可见转移灶裸鼠数/每组裸鼠数×100%。　　1.8统计学方法 　　应用ORIGIN6.0统计软件对所有结果进行卡方检验和方差分析等统计学方法处理，绘制相应图表。　　2结果　　2.1转化细胞形态　　转染后的HT29细胞由圆形变为长梭形或多边形，分散生长。体积增大，核大深染，染色质密集成块状，见多核及异常核分裂相，核浆比例增大。HT29细胞圆形、规则、体积小、大小均匀、核圆形、异常核分裂相少见，见图1。　　2.2细胞生长能力.L.编辑。　　从3种细胞的生长曲线中可见，HT29Hpa细胞的生长速度明显加快，生长线在三天后呈现持续升高的趋势；而HT29细胞和HT29KZ细胞上升缓和，并于七天后进入平台期，见图2。　　图2三种细胞生长曲线（略）　　2.3原位杂交结果　　HT29Hpa细胞和HT29细胞均有乙酰肝素酶mRNA阳性表达，HT29Hpa细胞表达增强，胞浆内有明显的阳性颗粒，幼稚细胞表达更加强烈，但不均匀。HT29细胞也有细胞表达，弱阳性，颗粒细小，比较均匀，见图1。mRNA表达积分如下：　　HT29Hpa细胞mRNA表达积分=60%×1+20%×2+25%×3=175%　　HT29细胞mRNA表达积分=12%×1+0%×2+0%×3=12%　　HT29Hpa细胞：HT29细胞mRNA表达积分=1.75:0.12　　2.4细胞侵袭转移能力　　HT29、HT29KZ和HT29Hpa细胞穿过人工基底膜的细胞数分别为29.3±1.7，30.1±2.5和45.5±3.2，HT29Hpa细胞与HT29细胞和HT29KZ细胞比较，穿膜数量明显增加，两者间差别具有显著性意义(P<0.01)。而HT29细胞和HT29KZ细胞穿膜细胞数的差别无显著性意义（P>0.05）。　　表1三种细胞体外侵袭能力（略）　　*P<0.05vsHT29,**P<0.01vsHT29andHT29KZ　　2.5流式细胞仪检测细胞周期 　　HT29细胞G1期平均值155.4，占86.5％。G2期平均值290.4，占5.9％。S期占7.6％，G2/G1为1.869。HT29Hpa细胞G1期平均值147.5，占63.8％。S期占19.6％。G2期平均值280.1，占16.6％。比较后可见，HT29Hpa细胞静止期细胞所占比例减少，DNA合成期所占细胞比例增加，表明细胞转化后分裂增生能力增强。　　2.6原位接种裸鼠转移　　裸鼠皮下种植瘤4周后，HT29细胞形成6mm×8mm×6mm，HT29Hpa细胞12mm×9mm×10mm两个实体瘤。裸鼠经回盲部原位种植实体瘤83d后，HT29Hpa组肉眼观察2例发生肝转移，于肝表面及切面可见多个直径在0.1～0.3cm大小灰白色的圆形转移灶，边界清楚，质地韧，镜下肝转移共5例，转移率为71.43%，见2例肺转移。对照组见镜下肝转移1例，转移率14.29%，2组间有显著差异，见图3、4。　　3讨论　　肿瘤的扩散、转移至少要有两次侵入、穿出基底膜的过程。穿越基膜屏障是肿瘤发生侵袭、转移的必然方式，基膜对其具有“限制性屏障作用”。HSPGs为一类存在于ECM和细胞表面的蛋白聚糖类线性碳水化合物，与许多活性分子结合，粘附于细胞表面，是构成BM的主要成分和ECM聚集和稳定的基础[4]。Hpa通过切断乙酰肝素侧链，破坏基底膜稳定的网状结构，同时释放结合在其上的生物大分子，如层粘连蛋白，表皮生长因子、基质金属蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活物等，参与炎症反应，促进血管生成，加速肿瘤生长，更易于癌细胞穿膜、侵袭和转移[5]。　　研究表明，对不同转移程度的人乳癌细胞进行检测，在非转移MGF7细胞没有观察到扩增的产物，在中度转移MDA231细胞中有表达，而高度转移MDA435细胞表达明显升高。表达的强度与酶的活性密切相关[2，6]。atrigel覆盖的滤膜能力，间接反映细胞的转移潜能。实验结果也显示转染后的细胞穿膜能力明显增强。这均表明，乙酰肝素酶可诱发细胞向低分化、高恶性状态发展，细胞对周围组织的侵袭能力增强。　　模拟生理过程的肿瘤动物模型，对于研究肿瘤细胞的生物特点、侵袭转移方式，以及进一步的诊断和治疗 具有重要意义[8,9]。我们将两种细胞接种在同一只裸鼠表皮下，最大限度的降低了荷瘤形成的影响因素，通过荷瘤回盲部原位接种，建立类似于临床结肠癌生长、转移裸鼠模型[10]，结果发现：乙酰肝素酶不仅能使实体瘤生长速度加快，而且能使癌细胞具有更强的侵袭转移能力。　　因此上述实验结果表明：乙酰肝素酶基因表达增强，可以促进肿瘤细胞的侵袭和转移能力。然而，其中肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用的级联反应在不同阶段所起的作用，与基膜蛋白相关性变化带来的瀑布式效应，以及乙酰肝素酶抑制、拮抗剂阻断肿瘤扩散、侵袭和转移的意义仍需深入研究。　　（本文图1.3.4见第298页）（略）【参考