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1、乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选论文刘玉，辛晓燕，毛敬，张潍【关键词】乙酰肝素酶ConstructionandidentificationofeukaryoticexpressionvectorexpressingdoubleshRNAsectionstargetingheparanasegene【Abstract】AIM:ToconstructandidentifyeukaryoticexpressionvectorexpressingdoubleshRNAsectionstargetingheparanasegene(HpashRNA).METHODS:
2、Sixpairsofoligonucleotidesicallysynthesized.AfterrandomlyconnectinganoligonucleotideandanotheroneidpGenesil1oterandterminationcode,themongreenfluorescenceprotein(EGFP)geneandNeogene.Inthisetryandfluorescencemicroscope.TheinhibitioneffectivenessofHpaproteinmunohistochemicalstaining.RESULTS:Th
3、econstructedeukaryoticexpressionvectorseffectivelysuppressedtheHpaexpressionintransfectedcells.The3vectorsofdifferentshorthairpinRNAofHpaeffectivelysuppressedtheexpressioninSKOV3（P0.01）.CONCLUSION:ETAFECTENE转染试剂盒操作方法转染，以含800mg/LG418的RPMI1640培养液培养4,接收光为530nm.用Cellquest软件进行数据获取与分析.1.2.6免疫组化染色检
4、验细胞Hpa蛋白表达细胞爬片，乙醇固定，按SABC方法染色.胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，每张切片在400倍显微镜下随机计数300个细胞.阴性（－）：不着色；阳性（+）：细胞质内有细小稀疏黄色颗粒；（）：细胞质内有较密的细小黄色颗粒；（）：细胞内有明显的细小黄色颗粒.将结果按下面公式计算.细胞Hpa蛋白表达积分＝（+）%×1+（）%×2+（）%×3.2结果2.1pGenesil1HpashRNA重组质粒的构建重组质粒用BamHI做酶切鉴定,阳性克隆产生400bp的片段.证实已将合成的DNA片段成功插入载体pGenesil1中（图1）.2.2测序分析经测序结果证实3个质粒构建部分的
5、碱基序列与设计DNA片段完全一致，碱基无突变.表明已成功构建含两段目的shRNA片段的重组质粒载体.2.3转染效率稳定转染4orBiol,2004,25:329-336.［2］ZhuJ,MuscoML,GraceMJ.ThreecolorfloetryanalysisoftricistronicexpressionofeBFP,eGFP,andeYFPusingEMCVIRESlinkages［J］.Cytometry，1999，37:51-59.［3］BoydDD,NakajimaM.Involvementofheparanaseintumormetastases:Anean
6、epithelialcancercellsinducesRNAidependentapoptosis［J］.Oligonucleotides,2004，14:239-248.［5］ScherrM,BattmerK,SchultheisB,etal.RNAinterference(RNAi)asanoptionforantibcrabltherapy［J］.GeneTher,2005，12:12-21.［6］RytherRC,FlyntAS,PhillipsJA3rd,etal.siRNAtherapeutics:BigpotentialfromsmallRNAs［J］.Gene
7、Ther，2005，12:5-11.［7］FougerollesA,ManoharanM,MeyersR,etal.RNAinterferenceinvivo:ToallinhibitoryRNAbasedtherapeutics［J］.MethodsEnzymol,2005，392:278-296.［8］SekiM,IanprostatePC3carcinomaxenograft,usingtransferringfacilitatedlipofectiongenedeliverystra
