靶向细胞周期蛋白e的shrna真核表达载体的构建和鉴定

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1、靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体的构建和鉴定【摘要】　　［目的］构建靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体。［方法］针对cyclinE基因，设计1对寡核苷酸，形成双链后将其将其插入Psilencer2.1-U6-neo质粒，构建cyclinEshRNA真核表达载体，酶切和测序鉴定。转染MCF-7细胞株，应用eddouble-strandedDNAsedigestionandsequenceanalysisandtransfectedintoMCF-7cells.TheexpressionofcyclinEedigestion

2、andsequenceanalysis,theexpressionvectorsofPsilencer2.1-U6/shRNAentalbasisforcancergenetherapybyRNAitechnique.Keybion公司），T4DNALigase、BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ（NEB公司），MCF-7细胞株（浙江大学医学院病理教研室惠赠），半干转膜仪（BIO-RAD）。1.2实验方法1.2.1shRNA表达载体的构建分别合成编码发夹结构shRNA的正义链和反义链，结构如下：BamHⅠ+Sense+Loop+Antise

3、nse+终止信号+SalⅠ+HindⅢ，针对cyclinE基因的序列为：P1:5′-GATCCGATTTCTTTGACCGGTATATTCAAG-ACGTATACCGGTCAAAGAAATCTTTTTTGTCGACA-3′，P2:3′-GCTAAAGAAACTGGCCATATAAGTTCTG-CATATGGCCAGTTTCTTTAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′，对照shRNA的序列为：P1:5′-GATCCGACTT-CATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA

4、-3′，P2:3′GCTG-AAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCCGTACG-CGGAATACTTCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′。分别取2ml正反义寡核苷酸(终浓度均为25mmol/L)，16ml退火缓冲液(200mmol/LNaCl，20mmol/LTris)，94℃水浴5min，然后自然冷却至室温。将退火后的双链siRNA模板与Psilencer2.1-U6-neo质粒表达载体于16℃连接过夜。以连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体。从每个培养皿上各挑取3个单菌落

5、接种于3ml含Ampr抗性（终浓度为50mg/ml）的LB培养液中，37℃恒温摇床（250r/min）培养过夜。用试剂盒小量提取质粒，并分别用SalⅠ做酶切鉴定。收集酶切鉴定正确的重组质粒，进行DNA测序。1.2.2细胞培养及siRNA转染MCF-7细胞培养体系为含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养。转染24h前，传代至6孔培养板，每孔2.5×105个细胞。实验分空白组、对照组和siRNA实验组。空白组不经任何处理，对照组转染阴性对照shRNA表达载体1μg，实验组转染shRNA-cyclinE表达载体1μg。用LIP

6、OFECTAMINE2000脂质体转染试剂进行转染，于37℃、5%CO2转染48h后，收获细胞。1.2.3SF，100mmol/LLeupeptin，1mmol/LNa3VO4)裂解，10kg×10min离心收集上清液，Bradford法测蛋白含量。取25μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜（BIO-RAD半干转膜，24V、24min），鼠抗人cyclinE(1∶1000)，二抗(1∶7000)，SupersignalassagueJ.G1cell-cyclecontrolandcancer[J].Nature,2004,432

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