靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

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1、靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定【摘要】目的构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列，设计4条干扰片段，以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体，构建shRNA重组体，转化入DH5a大肠杆菌，提取质粒，进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞，用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定，成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞，经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用

2、RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒，并转染入Colo-16细胞。【关键词】表皮生长因子受体;RNA干扰;短发卡状RNA;转染　　Abstract：ObjectiveToestablishandidentifytheplasmidexpressionvectorencodingshorthairpinRNA(shRNA)targetingepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)ofhumangene.Methods①FourshorthairpinRNAs(shRNA)weredesignedaccordingtotheh

3、omosapiensEGFRmRNAID,andthenrecombinantshRNAwasreconstructed,withPGPU6/GFP/Neoplasmidsasvectors,respectively.TheplasmidsweretransferredintoE.coliDH5αforplasmidextractionandthesubsequentidentificationby12enzymedigestingandsequencing.②FourrecombinantplasmidsweretransfectedintoColo-16cellswi

4、thlipofectamine2000andwerescreenedforpositiveclonesbyG418.Results①Theresultsofenzyme-digestionsequencingconfirmedthatfourplasmidscontainingshRNAweresuccessfullyconstructed.②FourrecombinantplasmidsweresuccessfullytransfectedintoColo-16cellsandthecellcloneswithstableexpressionwereobtained.C

5、onclusionWithRNAitechnology,therecombinantshRNAplasmidstargetingEGFRweresuccessfullyestablishedandtransfectedintoColo-16cells.　　Keywords:epidermalgrowthfactorreceptor;RNAinterference;smallhairpinRNA;transfection　　表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)属于表皮生长因子家族[1](erbB家族)，为原癌基因C-erb

6、B(HER-1)的表达产物，是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，它与表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)、转化生长因子(transferringgrowthfactor12,TGF)等配体结合，能激活酪氨酸激酶受体，导致酪氨酸残基的磷酸化，促进细胞无节制地增殖分裂，导致恶性肿瘤的发生[2]。阻断EGFR可抑制肿瘤生长，其作用机制可能与抑制细胞周期进程、加速细胞凋亡、抑制血管生成、抑制浸润和转移、增强化、放疗敏感性等有关[3]。小干扰RNA(siRNA)[4]与同源性mRNA结合,可靶向切断降解此mRNA,在蛋白翻译前抑制基因表达[5]。我们构建编码

7、EGFR的短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体,并对其进行鉴定,为皮肤鳞癌的靶向治疗寻找新的途径。　　1材料和方法　　1.1材料空质粒PGPU6/GFP/Neo为Genepharma公司产品。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶为美国Promega公司产品。Lipofectamine2000转染试剂盒为Invitrogen公司产品。感受态菌DH5a购于博大泰克公司;质粒抽提试剂盒购于Promega公司;G418、卡那霉素购于Sigma公司;人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞由中国医学科学院皮肤病研究所周武庆教授惠赠;R