资源描述：
《人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定作者：谢桥生雷小英王立锋孟艳玲王芳薛茜温伟红杨安钢【摘要】目的：构建人Smad3的shRNA表达载体，运用RNAi下调Smad3基因在肿瘤细胞系中的表达，观察对肿瘤细胞生长的影响•方法：化学合成针对人Smad3基因的dsRNA,瞬时转染入Hela细胞，检测RMA干扰效果，筛选冇效干扰靶位点；设计并合成针对人Smeicl3基因的siRNA寡核昔酸链，经退火形成双链后克隆入质粒载体pSilencerTM3.1Hlhygro,转染入Hela细胞，JJ]hygromycinB筛选稳定单克隆细胞株，对细胞株行RTPCR和WesternBlot检测
2、，观察siRNA对靶基因的抑制效果，进一步研究下调FI的分子表达水平以后肿瘤细胞生长的变化.结果：瞬时转染筛选到了冇效的RNA干扰靶位点，构建载体后，建立稳定转染的单克隆细胞株,Smad3mRNA和蛋白质水平均显著下调，导致肿瘤细胞生长抑制.结论：成功构建了针对人Smad3高效、特异、作用持久的shRNA表达载体,转染细胞后可下调Smad3的表达，为进一步研究Smad3的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础.【关键词】Smad3；RNA干扰；遗传载体；肿瘤生长抑制0引言Smad家族成员是TGFB信号通路中的重要分子，根据其结构和功能的相似性，可分为三个亚家族，即RSmadsCrece
3、ptorregulatedSmads),CoSmadsCcommonSmads),和ISmads(inhibitorySmads)[1]・Smad3是RSmads中的一个成员，参与细胞增殖、分化、细胞外基质调节、肿瘤细胞迁移，与其功能相近的还有Smad2,Smadl,Smad5,Smad8.近年来,Smads信号通路在肿瘤细胞屮的作用逐渐引起人们的关注，有望成为肿瘤治疗中的潜在有效靶点[2-5]・我们通过瞬时转染dsRNA（doublestrandedRNA,双链RNA）入Hela细胞，筛选有效的siRNA（smallinterferenceRNA）序列，并构建shRNA（sm
4、allhairpinRNA）表达载体,建立持续低表达Smad3的稳定细胞株，以期进一步探求Smad3下调后对肿瘤牛物学性状的影响.1材料和方法1.1材料质粒载体pS订encerTM3.1Hlhygro山西京医院刘家云博士惠赠；大肠杆菌DII5a、宫颈癌细胞系Ilela由本实验室保存；细胞培养试剂、TRIZOLReagentRTPCR试剂盒、hygromycinB,LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；牛血清白蛋白（BSA）＞兔抗人antiSmad3多克隆抗体（sc8332,SantaCruz公司）；兔抗人且ntiActin多克隆抗体、HRP标记羊抗
5、兔二抗（武汉博士德公司）；NC膜（Millipore公司）；BCA法蛋白定量试剂盒＞WesternBlot发光液（Pierce公司）；各种限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒屮提试剂盒（Promega公司）・WesternBlot设备（BIORAD公司）；凝胶成像仪（ULTRAVIOLET公司）；高速离心机（Beckman公司）;紫外分光光度计（Ultrospec2000,PharmaciaBiotech公司）；PCR仪（PTC200,MJResearch公司）；酶联免疫检测仪(Model500,BIORAD公司).1・
6、2方法1.2.1siRNA的设计根据RNA干扰靶位点的设计原则，从Smad3mRNA(NM_005902)的编码序列屮寻找符合设计特征的靶位点，经BLAST软件进行同源分析证实为Smad3特异性序列后，选择其编码区第941-959位核昔酸为干扰靶位点，山上海吉玛公司合成其dsRNA序列，Smad3正义链:5'GCACAUAAUAACUUGGACCdTdT3',反义链：5'CGUGUAUUAUUGAACCUGGdTdT3’・由公司提供的阴性对照dsRNA与人类基因无同源性，正义链：5’UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3，,反义链:5'AAGAGGCUUGCACAGU
7、GCAdTdT3'•1.2.2shRNA表达质粒载体的构建按上述靶位点构建shRNA表达载体，根据pSilencerTM3.1IIIhygro质粒载体的要求设计1对能编码shRNA的寡核昔酸链，正义链：5’GATCCGCACATAATAACTTGGACCTTCAAGAGAGGTCCAAGTTATTATGTGCTTTTTTGGAAA3',反义链：5'AGCTTTTCCAAAAAAGCACATAATAACTTGGACCTCTCTTGAAGGTCCAAGTTATTATGTGCG3’；序列两端包含B
