干扰AFP蛋白表达shRNA表达载体构建及活性鉴定.doc

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1、干扰AFP蛋白表达shRNA表达载体构建及活性鉴定作者：张国英刘明社赵中夫*张芸杨慧武延隽【摘要】目的：利用含报告基因EGFP的pGenes订-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达的载体，并进行活性鉴定。方法：设计表达短发夹RNA的互补DNA序列，经退火成双链，克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenes订T中，构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5a菌株，扩增，提取质粒，酶切鉴定后测序分析。构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞，检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化，确定重组质粒的活性。结果：构建了靶向AFP蛋白的2个shRN

2、A重组质粒载体pGenesil-1-siAFPl和pGenesil-l-siAFP2o酶切鉴定和测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致，经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达。结论：成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体。【关键词】AFP蛋白RNAishRNA重组质粒载体AbstractObjective：ToconstructtherecombinantplasmidexpressingtwoAFP—targetedshorthairpinRNA(shRNA)withpGenesil-1plas

3、midsvector,andDetecttheActivityofRecombinantPlasmidinHepG2cells.Methods：TwopairsofDNAsequencesweredesignedandsynthesized,andformedcomplementarychainsbyannealingrespectively.Thentheobtainedproducts,siAFPlandsiAFP2,wereinsertedintoplasmidvectorpGenesil-1withU6promoter.Therecombinantplasmidsweretra

4、nsformingintotheEscherichiacolistrainDH5aforscreeningandamplifying.ThesequeneeanalysisoftheplasmidsandidentifiedbySalldigestionwascarriedout・ThebiologicalactivityofrecombinantplasmidwasdetectedbytransfectingintotheHepG2cellline・Results:ThetwoAFP-targetedshRNAsexpressingframeweresuccessfullyinser

5、tedintothepGensil-1plasmidvectorrespectively,andtheobtainedshRNAscodingsequenceswereconsistentwiththedesignedfragments.TherecombinantplasmidinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2cells.Conclusion：TheconstruetionoftworecombinantplasmidsofAFP-targetedshRNAwassuccessful.Tworecombinantplas

6、midsexpressingAFP—targetedshRNAinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2cells.KeyWordsAFP；RNAinterference；ShorthairpinRNA；HepG2cells长期以来，人们只是把AFP作为一个肿瘤标志物，用于原发性肝癌(HCC)的诊断指标之一。诸多研究关注于检测甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)对原发性肝癌诊断运用，而对AFP和肿瘤细胞发生及增殖的关系并不完全清楚［1〜3］o近年发展起来的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术

7、为探索AFP的生物学功能提供了有力的工具。RNAi技术是通过导入细胞19nt〜23nt的小分子干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA),降解同源mRNA,高效、特异性阻断目的基因表达［4〜7］。本研究针对人AFP基因设计了2个位点的shRNA表达序列，用人U6启动子和RNApolymeraselll(PolIII)终止信号，构建针对AFP的特异性shRNA真核表达载体，并转染HepG2细胞鉴定活性，探索RNAi技术在沉