资源描述：
《ROCKⅡ基因shRNA质粒表达载体的构建与鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、ROCKII基因shWX质粒表达载体的构建与鉴定作者：李晓江白云深杨有庚【摘要】目的构建表达Rho激酶&邓H特异性silW勺重组质粒。方法按照Elbashir等设计原则和表达载体的要求，利用Anbion公司在线siRNA.Tatgetfinder软件，设计带有BarrHI、BbsI酶切黏性末端、终止识别序列和IOT环的shR巴并将其克隆入载体pGEWOWo构建成rockn特异siim重组质粒，然后进行酶切鉴定及基因测序。结果设计的shWV成功克隆入载体pGEUgWq构建成ROCK0特异siRN連组质粒,酚切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符
2、，冃的基因序列准确无误。结论重组质粒构建成功，为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供了一种有效的方法。【关键词】载体构建；观干扰；ROCK砂。激酶）磋4干扰（mi）是由双链曲介导的、在转录后ni2水平关闭相应基因表达的过程。将与靶基因转录产物存在同源互补序列的双链RN（dsW导入细胞后，生成的小干扰Z（si眄与imi特异性酶结合，形成^^4诱导的沉默复合物，具有序列特异性核酸内切酶活性，能特异性降解该从而产生相应的功能表型缺失。本研究采用含Hl启动子的载体pGWWfeo,针对nts基因超家族中Rho激酶&砂基因的短发夹
3、结构im（shR网构建靶向ROCKU特异性shRNX真核表达载体，为今后体外或体内研究R0CK基因在脊髓损伤后的功能修复提供一种有效方法。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器生化培养箱、震荡培养箱金坛仪器厂），荧光显微镜CAMPUS公司）。连接试剂盒、小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒Q2GEN公司），限制性内切酶（TaKaRa公司）。1.2shRNA序列设计及合成根据pGPUgWo中H1启动子启动表达si时対序列的要求，利用Anbion公司在线siRN4Tatgetfinder软件、•设计合成4条针对大鼠ROCK序列的siR^EMX片段，分析获
4、得的序列，选择OC含量在4吆〜55%之间的靶基因序列作为潜在优选，并在GenBank表达序列标签颐数据库屮用BIASI检索，将选定的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列同源的序列，以确定其为特异性序列。为了提高序列正确退火成为双链子的效率，将包含目的SiRNA序列的D3设计为用聚合酶合成的RR策略分别设计）包含目的基因siRNA序列的正义链和反义链寡核昔酸序列，在正义链和反义链序列加入间隔序列TKNC©以避免形成终止信号，使其能形成发夹结构，shRNA的转录终止序列采用T6结构。止义链模板的5端添加了CCC与Bbs1酚切后形
5、成的黏端互补;反义链模板的5端添加了GAIC；与EanHI酶切后形成的黏端互补;如果siRWj第1个碱基不是G则在CCC后补加1个G随机选取排列序列作为无干扰效果对照序列。编码silW勺cm序列由上海生工合成。4条寡核昔酸链及反义链见表L表1设计、合成的4对R0CK特异性siRW点、寡核昔酸链序列及住含量1.3shRN碾板的退火将rmoligo分别用TE©H8・0溶解，浓度为100卩mol/L取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系：10XshLNX退火缓冲液5卩1,正义链（100pimo1/05pi1,反义链（1
6、00卩mo1/05pt1,ddH2O35
7、i1,总体积50卩1。在PCR仪丄按照如下程序进行退火处理：95C5min,85C5min,75C5min,7（JC5min,4C保存。退火处理后得到浓度为10pimol/L的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20ITOD14用于连接反应。1.4pCJWGFWeo载休的线性化取2gpGPUgWo载体，按照如下体系进行酶切处理：10X缓冲液G5pi1,BbsI2pt1,BanHI2卩1,pGUgE很eo2）ig,dcH2O411,总体积50piL37'C酶切1h,琼脂糖电泳，使用Ag
8、aroseGelHNAPurificationKitWrZ0（TaKaR^BI收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50n咏101.5pGlWWeoshRMY载休的构建按照如下休系进行载体的连接反应：10XT4连接缓冲液2pi1，pCRWWo(BbsmanHDl
9、i1?shRN碾板(20nmol/01pi1,TiEN锻接酚(5wissW1)11?dcH2O151,总体积20卩lo22C1h,转染到JM109ccnpetent细胞。每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50卩g/nlKanamycin的LB培养集中。使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用Ba
10、nHLPstI分别酶切鉴定。阳性重组载体应该可以被BantiI切开，而不能被PstI切开。重组载体的确切鉴定见图lo酶切结果表明，所有质粒均为阳性重组载体，每组选择两个克隆进行测
