smad4 shrna真核表达质粒的构建及鉴定

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1、smad4shRNA真核表达质粒的构建及鉴定作者：吴鹏，田媛，桂伶俐，陈刚，卢运萍，周剑锋，马丁【摘要】目的针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil1中,构建smad4shRNA表达载体pGenesilsmad4shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果3

2、个smad4shRNA表达载体pGenesilsmad4shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RTPCR、ethodsThree19bpreverserepeatedmotifstargetingofsmad4geneidpGenesil1containingU6shRNApromoterandterminationsignalofRNApolymerase.TherebinantplasmidspGenesilshRNA1,2,3andpGenesilconinereagent.Thealterationofs

3、mad4expressioninedbyRTPCRand)CATTCCAGCCTCCCATTTCCA(TAMRA)3'Forad4和内参照18sRNA的RTPCR引物序列见表1。　　1.3smad4短发卡式RNA(shRNA)的设计采用clontech在线设计软件选择smad4cDNA序列上3个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列打乱设计为阴性对照,对照序列经BLAST检测证实与smad4mRNA及其他基因编码序列无同源性。为鉴定设计片断是否插入载体，polyT后加上salI的鉴定酶切位点。以上序列由上海英骏生物技术有限公司

4、合成，序列见表2：　　表2smad4shRNA干扰序列（略）　　1.4smad4shRNA表达质粒的构建用50μlannealingbuffer溶解上述单链目的基因片段.各取2μl单链和16μlannealingbuffer,94℃退火自然冷却至室温。T4DNA连接酶将准备好的插入片断连接到纯化质粒pGenesil1的BamHI和HindIII之间,16℃过夜,构建成对照载体pGenesilcon和smad4shRNA表达载体pGenesilsmad4shRNA，转化至DH5α感受态细菌,涂于含卡那霉素的培养板中,37℃培养过夜。随机挑选卡

5、那霉素抗性的转化克隆摇菌扩增。　　1.5smad4shRNA表达质粒的鉴定提取的质粒经salI酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,判断酶切产物大小。并将阳性克隆送上海英骏生物技术公司测序，以鉴别插入片断是否含有碱基突变。　　1.6smad4shRNA转染HeLa细胞用脂质体Lipfectinamine2000将重组阴性对照载体pGenesilcon、pGenesilsmad41、2、3分别转染宫颈癌细胞株HeLa，命名为H/CON,H/shRNA1、2、3,并以HeLa细胞作为空白对照。在转染第2天将细胞以1∶10的稀释比例传代培养,两天后用含800

6、μg/mlG418的选择培养液连续培养2周,隔天换液一次,有限稀释法挑选单个抗性细胞在G418(200μg/ml)下常规培养扩增。　　1.7流式细胞仪和荧光显微镜检测转染率取HeLa、HeLa/con和HeLa/shRNA1、2、3细胞各1×106个,制成单细胞悬液后流式细胞仪检测104个细胞的相对荧光强度(RFI)和荧光表达率(其激发波长475nm,发射波长490nm)。取细胞常规铺片,置于荧光显微镜下观察并计算转染率。转染效率(%)=(发出绿色荧光的细胞数/可见光下总细胞数)×100%。　　1.8转染细胞smad4mRNA的检测　　1.8.1

7、RTPCR检测smad4mRNA水平本实验以18sRNA作为内参照。TRIzol提取细胞总RNA,取2μgRNA作逆转录,反应体系25μl,dNTP(10mmol/L)1μl,randomprimer（0.3μg/μl）2μl,逆转录酶12U,RNA酶抑制剂20U,5×逆转录缓冲液5μl。42℃1h,95℃5min灭活逆转录酶，加无核酶水稀释5倍。在stratageneMP3000(美国stratagene公司)实时荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增：反应体系25μl,包含上、下游引物各0.4μmol/L,TaqMan探针0.2μmol/L,2

8、×TaqManPCR通用共同组分(Takara公司)12.5μl，1μlcDNA。PCR反应条件为第一步:95℃10min1个循环;第二