医学毕业论文smad4shrna真核表达质粒的构建及鉴定

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1、smad4shRNA真核表达质粒的构建及鉴定姓名：2014年6月25日smad4shRNA真核表达质粒的构建及鉴定作者：吴鹏，田媛，桂伶俐，陈刚，卢运萍，周剑锋，马丁【摘要】目的针对smad4基因的不同部位，构建不同smad4shRNA表达质粒载体，在转录后水平抑制smad4的表达，对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil1中，构建smad4shRNA表达载体pGcncsilsmad4shRNAk2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HcLa，经G418筛选抑制smad4表达

2、的稳定细胞克隆。结果3个smad4shRNA表込载体pGenesilsmad4shRNAk2>3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RTPCR、Westernblotting均证实：3种shRNA重组质粒中pGenesilsmad4shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论成功构建了smad4shRNA表达载体pGcncsilsmad4shRNAl、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的兑隆。此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。【关键词】宫颈癌;shRNA;smad4Abstract：ObjectiveT

3、oexplorethefeasibilityofselectiveinhibitingsmad4expressionusingsmad4shorthairpinRNA(shRNA)interference.MethodsThree19bpreverserepeatedmotifstargetingofsmad4geneweresynthesizedandclonedintoeukaryoticexpressionplasmidpGenesil1containingU6shRNApromoterandterminationsignalofRNApolymerase.Therecombin

4、antplasmidspGenesilshRNA1，2,3andpGenesilconweretransfectedintoHeLacellsrespectivelybylipofectaminereagent.Thealterationofsmad4expressionwasexaminedbyRTPCRandWesternblot.Resultsltwasverifiedbypartialnucleotidesequencingandrestrictionendonucleasedigestionthattheconstructedeukaryoticvectorexpressin

5、gshRNAofsmad4wascorrect.shRNA2inpGenesilsmad4cellsknockeddowntheexpressionofsmad4mRNAandproteindramaticallycomparedwithuntransfectedandcontrolcells.ConclusionTheshRNAcanefficientlysuppresssmad4expressioninHeLacells.Theresultsofthestudylaythefoundationforfurtherstudyingonbiologicalfunctionsandpot

6、entialapplicationofsmad4.Keywords：Cervicalcancer;shRNA;smad40引言TGFp/smads信号转导通路是由TGFp超家族、TGFP受体、smads蛋白家族及其核内转录调节因子组成的肿瘤抑制通路。通路中任何元件异常都可以引起TGFp/smads信号转导紊乱，从而导致肿痛的发土。而smad4是调节转录和TGF(3抗增殖应答的核心分子，在肿瘤中的火活表明它是抑癌基因，smad4突变或表达丢失与多种肿瘤的发生有关。因此，我们构建了针对smad4的特异性短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体，转染宫颈癌细胞株HeLa，得到了基因表达抑制作

7、用较强的永久干涉细胞克隆，为研宂宫颈癌细胞的恶性生物学行为奠定基础。1材料与方法1.1材料真核表达质粒载体pGcncsil1购于武汉晶赛生物技术有限公司，宿主菌DH5(x为北京天为时代公司产品。宫颈癌细胞株HeLa购于屮国典型物保藏中心。各工具酶为Takara公司产品；Lipfectinamine2000脂质体转炎试剂盒为Invitrogen公司表lsmad4和18sRNArealtimePCR引物序列Geneprimersequencelen