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《pegfp_n1_bmp_2真核表达质粒的构建与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中国实验诊断学 2009年12月 第13卷 第12期—1683—文章编号:1007-4287(2009)12-1683-03pEGFP2N1/BMP22真核表达质粒的构建与鉴定3张明磊,常 非,高忠礼,柳 扬,刘光耀(吉林大学中日联谊医院骨科,吉林长春130033)摘要:目的 构建pEGFP2N1/BMP22真核表达质粒,并进行鉴定。方法 利用RT2PCR方法从组织中提取骨形态发生蛋白(BMP22)的基因片段,与pMD182T载体连接,构建pMD182T/BMP22重组质粒,酶切后与pEGFP2N1真核表达载体连接,构建pEGFP2N1/BMP22真核表达质粒,进行测
2、序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果 通过测序、酶切鉴定,证明pMD182T/BMP22质粒构建成功。结论 本实验成功构建了pEGFP2N1/BMP22真核表达质粒,为进一步研究利用BMP22基因修饰骨组织工程骨种子细胞提供实验基础。关键词:pEGFP2N1;骨形成蛋白2;基因中图分类号:R34文献标识码:AConstructionandidentificationofeukaryoticexpressionvectorpEGFP2N1/BMP22ZHANGMing2lei,CHANGfei,GAOZhong2li,etal.(China2JapanUnionHosp
3、italofJilinUniversity,Changchun130033,China)Abstract:ObjectiveToconstructaeukaryoticexpressionvectorcarryingBMP22gene.MethodsBMP22genewasclonedfromtissuebyusingRT2PCRmethodandwasinsertedintopMD182TtoconstrcuctpMD182T/BMP22plasmid,andtoconstructpEGFP2N1/BMP22plasmidbyusingrestrictionenzy
4、me.Toidentifytheplasmidbysequencingandrestrictionenzyme.ResultsTheeukaryoticexpressionvectorpEGFP2N1/BMP22wasconstructedandidentified.ConclusionToconstructtheexpressionvectorsuc2cessfully,BMP22genewasabletowasforboneengineering.Keywords:pEGFP2N1;BMP22;gene(ChinJLabDiagn,2009,13:1683) 在
5、新生骨组织的形成过程中,多种相关细胞因司),AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒子参与其中并起到十分重要的作用,通过细胞因子DNA小量提取试剂盒(Axygen公司),限制性内切酶的浓度发生改变,继而通过募集祖细胞,发挥调节细(TaKaRa公司)。胞的增殖和分化等作用。BMPs是一种能够启动成1.2 方法骨分化,并作用于整个成骨过程的细胞因子。其中1.2.1引物设计 根据GenBank上BMP(登陆号BMP22被认为具有最强的诱导成骨能力。并已广泛NM-017178)序列,应用PrimerPrim5.0软件设计、合用于骨组织工程学。外源性细胞因子的使用
6、存在生成PCR引物。物半衰期较短,在体内较快降解且易随体液扩散,很BMP1:5’TAGTGCTTCTTAGACGGACTGCGGT3’难在损伤区保持足够时间的有效生物活性等缺点。1223bp随着基因工程和分子生物学技术的发展,现在已经BMP2:5’ggtaccaATGGTGGCCGGGACCCGCTGT能够将目的基因导入靶细胞,进而持续、稳定、高效CTTC3’1182bp的表达,为细胞因子提供了良好的应用方法。本实1.2.2组织RNA提取及逆转录 将样品中加入验构建pEGFP2N1/BMP22真核表达质粒,并进行测TRIzolReagent研磨均匀,提取总RNA,之后
7、按照逆序及酶切鉴定,为进一步研究利用BMP22基因修饰转录试剂盒说明合成cDNA。骨组织工程骨种子细胞提供实验基础。1.2.3RT2PCR扩增目的基因 PCR扩增条件如下:1 材料与方法94℃变性5min,94℃30s、55℃45s、72℃35s循环1.1 材料 胎鼠,pEGFP2N1载体(Clotech公司),40次后,72℃最后延伸5min。取扩增终产物与TRIzolRaegent(Invitrogen公司),大肠杆菌Top10感受DL2000marker一起进行琼脂糖凝胶电泳。切下目的态细胞(广州威佳科技有限公司),DEPC(Sigma公条带,
