9ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达

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1、9ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达作者：何永林，朱道银，伊正君，杨春，徐蕾【关键词】颗粒溶素；真核表达质粒；分泌表达Constructionandsecretingexpressionofeukaryoticexpressionplasmidcarryinghuman9kugranulysingene[Abstract]AIM:Toconstructsecretingeukaryoticexpressionplasmidcarryinghuman9kugranulysingeneandtolayafoundationforthestudyofgranulysinasant

2、itumorgenetherapyagent.METHODS:AfteramplifiedbyPCRfromtheplasmidincludinggranulysincomplementarydeoxyribonucleicacid(cDNA),9kugranulysingenefragmentcarryingleaderpeptidegenewasclonedintopBudCE4・1toconstructrecombinantplasmidpBudCE4.1S9K・IdentificationofpBudCE4.1S9KwasconductedbyPCR,restrictio

3、nenzymedigestionandsequencing・TherecombinantplasmidwastransfectedintoRAW264.7cells,anditstransientexpressionwasdetectedbyRTPCR,immunocytochemistryandDotELISA.RESULTS:9kugranulysingenefragmentineludingleaderpeptidegenewasobtained;itwasconfirmedthatgenewasinsertedintoeukaryoticexpressionplasmid

4、correctly;9kugranulusincanbeexpressedandsecretedintransfectedcells・CONCLUSION:EukaryoticexpressionplasmidpBudCE4.1S9Kcarryinghuman9kugranulysingenewasconstructedsuccessfully.[Keywords]granulysin;eukaryoticexpressionplasmid;secretingexpression【摘要】冃的：构建能分泌表达人9ku颗粒溶素(granulysin)的真核质粒，为下一步利用颗粒溶素基

5、因治疗肿瘤奠定基础.方法:以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段后，定向插入真核表达载体pBudCE4.1中，获得重组表达质粒PBudCE4.1S9K,通过PCR,双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定；采用RTPCR,免疫细胞化学与DotELISA法检测pBudCE4.1S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.结果：成功扩增出含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段；经酶切，PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒；转染细胞证实可分泌表达9ku颗粒溶素.结论：成功构建能分泌表达9ku颗

6、粒溶素真核表达质粒pBudCE4.1S9K.0引言肿瘤是一类严重影响人们身体健康和生活质量的疾病.肿瘤的基因治疗是继手术、化疗和放疗之后出现的一种新型治疗手段，已成为抗肿瘤研究的热点.颗粒溶素是人体NK,CTL细胞产生的一种具有抗菌、抗肿瘤的免疫效应分子［1］,含15ku的前体形式和9ku的活性形式.重组的9ku颗粒溶素可引起多种肿瘤细胞凋亡.但由于抗菌的作用，采用基因工程方法获得大量的活性颗粒溶素分子比较困难，限制了其的直接应用.冃前国内外应用9ku颗粒溶素在体内进行肿瘤基因治疗的相关报道也较少.本研究旨在构建9ku形式的颗粒溶素真核表达质粒，并加上15ku的分泌肽cDNA序列

7、，以期分泌表达，为下一步应用肿瘤靶向载体携带颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础.1材料和方法1.1材料RAW264.7细胞，E.coliTOP10为重庆医科大学免疫学与微生物学教研室保存；多启动子共表达载体PBudCE4.1购自美国Invitrogen公司；含9ku颗粒溶素的cDNA质粒pZM03由重庆医科大学免疫学与微生物学教研室构建［2］；RNA提取试剂盒，cDNA逆转录试剂盒，琼脂糖等均购自上海生工；rTaq酶，Pyobest酶，限制性内切酶，快速连接试剂盒均购自大连宝生物公司；