9 ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达论文

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1、9ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达论文何永林，朱道银，伊正君，杨春，徐蕾【关键词】颗粒溶素；真核表达质粒；分泌表达Constructionandsecretingexpressionofeukaryoticexpressionplasmidcarryinghuman9kugranulysingene【Abstract】AIM:Toconstructsecretingeukaryoticexpressionplasmidcarryinghuman9kugranulysingeneandtolayafoundationforthestudyofgranulysinas

2、antitumorgenetherapyagent.METHODS:AfteramplifiedbyPCRfromtheplasmidincludinggranulysinplementarydeoxyribonucleicacid(cDNA),9kugranulysingenefragmentcarryingleaderpeptidegeneidpBudCE4.1S9K.IdentificationofpBudCE4.1S9Kedigestionandsequencing.TherebinantplasmidmunocytochemistryandDotELISA.RE

3、SULTS:9kugranulysingenefragmentincludingleaderpeptidegeneedthatgeneidcorrectly;9kugranulusincanbeexpressedandsecretedintransfectedcells.CONCLUSION:EukaryoticexpressionplasmidpBudCE4.1S9Kcarryinghuman9kugranulysingeneid;secretingexpression【摘要】目的：构建能分泌表达人9ku颗粒溶素（granulysin）的真核质粒，为下一步利用颗粒溶素基

4、因治疗肿瘤奠定基础.方法：以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段后，定向插入真核表达载体pBudCE4.1中.freelineTM2000购自重庆百瑞生物技术公司（Invitrogen公司产品）；抗颗粒溶素兔IgG抗体购自基因公司（美国SANTACRUZ生物技术公司产品）；DAB显色试剂盒，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德生物技术有限公司；硝酸纤维素膜（NC膜）购自北方同正生物技术发展公司.1.2方法1.2.1pBudCE4.1S9K质粒的构建根据基因库中的人颗粒溶素编码

5、序列(登录号：NM_006433)，将颗粒溶素15ku前体分子的分泌肽基因45bp［1］与9ku活性片段(222bp)的cDNA的N端23bp共68bp设计为引物P1，P1：ATGGCTACCTGGGCCCTCCTGCTCCTTGCAGCCATGCTCCTGGGCGGCCGTGACTACAGGACCTGTCT.再根据带分泌肽的9ku的cDNA序列（共267bp）分别设计引物P2，P3分别含有HindIII和BamHI酶切位点，引物P2：5′ATAAGCTTACCATGGCTACCTGGGCCCTCCTGC3′，插入HindIII酶切位点，同时添加ACC，使ATG位于ACC

6、ATGG的KOZAK序列中（有利于真核细胞蛋白翻译起始）；引物P3：5′AGGGATCCTCACCTGAGGTCCTCACAGATCTGCTGG3′，插入BamHI酶切位点和终止密码对应序列.以pZM03为模板PCR扩增含分泌肽的9ku基因片段，反应体系：10×buffer5μL，2.5×dNTP8μL，Pl，P2各0.5μL，P31μL,Probest酶0.5μL,模板1μL，灭菌去离子水33.5μL，共50μL；扩增条件：94℃3min;94℃30s，61℃30s，72℃1min，共30循环；72℃5min.扩增产物用12g/L琼脂糖凝胶电泳检测.用HindIII/B

7、amHI酶切PCR产物，并用相应的酶消化载体质粒pBudCE4.1，回收目的DNA片段.根据连接试剂盒说明操作，将分泌型9ku活性片段基因定向克隆进载体质粒pBudCE4.1中，构建含分泌肽基因片段的重组9ku颗粒溶素真核表达质粒pBudCE4.1S9K.将重组质粒转化感受态E.coliTOPl0，然后在含Zeocin抗生素的低盐LB培养基进行筛选.抽提重组质粒酶切鉴定，并送博亚生物技术公司测序鉴定.1.2.2细胞转染RAI1640培养基生长至80％汇片，用重组pBudCE4.1S9K质粒进行转染，以pBudCE4.1空质粒和