mgitrl真核表达质粒的构建及其在lewis细

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1、mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细【摘要】目的：构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，体外转染小鼠肺癌细胞株LeGITRL基因，克隆至pIRES2-eGFP载体，选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染LeGITRL，基因测序与GenBank中发表的序列完全一致，体外转染LeGITRL。结论：成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，并在小鼠LeGITRLgenepIRES2-eGFP/mGITRLandtransfectitintoLeGITRLge

2、neplifiedfromintermediatevectorPMD18-T/mGITRLbyPCRandinsertedintopIRES2-eGFPvector,andthesequenceofDNAGITRLgeneidpIRES2-eGFP/mGITRLologyRNAformGITRLinGenBank.mGITRLgeneandtheproteincouldbedetectedbyRT-PCRandFCMinthetransfectedLeGITRLvectorhasbeenconstructedsuccess

3、fullyandornecrosisfactorreceptorligand；celltransfection；tumor　　肿瘤严重危害人类健康，免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要手段。研究发现调节性T细胞抑制效应性T细胞，在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用，体内清除调节性T细胞则有利于抗肿瘤免疫应答［1］。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-inducedtumornecrosisfactorreceptor，GITR）是胸腺的CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell，Treg

4、）的重要表面标志，其配体（GITRligand,GITRL）具有解除Treg免疫抑制功能的作用［2］。本研究构建pIRES2-eGFP/mGITRL真核表达质粒，体外转染小鼠肺癌细胞株LeGITRL（eBioscience公司），Trizol及逆转录试剂盒（Invitrogene公司），DNA聚合酶，dNTP，EcoRⅠ及SalⅠ核酸内切酶，DL2000，λ-EcoT14ⅠdigestDNA相对分子质量标准（TakaraBiotec公司），PCR产物纯化试剂盒（Macherey-Nagel公司），质粒提取试剂盒（Axyge

5、n公司），大肠杆菌DH5α，LeerPremier5.0软件设计引物，由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列：上游引物：5′-GAGAATTCATGGAGGAAATGCCTTGAG-3′,下游引物：5′-CCCGTCGACCTAAGAGATGAATGGTAGATC-3′，引物中增加了EcoRⅠ（GAATTC）及SalⅠ（GTCGAC）2个酶切位点。　　1.3pIRES2-EGFP/mGITRL克隆及鉴定　　以mGITRL-TA质粒［3］（本室保存）为模板，通过PCR扩增获得mGITRL基因。PCR反应体系包括2.5μl1

6、0×缓冲液，2μl2.5mmol/LMgCl2，2.5μl2mmol/LdNTP，2μl模板，0.25μlExTaq酶（5U/μl），1μl上游引物及下游引物，13.75μlH2O，总体积25μl。PCR反应条件为94℃预变性2.5min,然后94℃变性30s，62℃退火30s,72℃延伸1min，共进行35个循环，再72℃延伸5min。PCR扩增产物通过Macherey-Nagel公司的Nucleospin试剂盒进行纯化。用EcoRⅠ和SalⅠ分别对上述纯化产物及pIRES2-eGFP进行双酶切，分别进行胶回收，回收的目

7、的片段和载体在室温下利用T4DNA连接酶连接1h，连接产物转化DH5α宿主菌后，接种含50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单个菌落，转种LB培养基（含50μg/ml卡那霉素），抽提质粒，酶切，电泳鉴定。　　将经过鉴定的阳性重组质粒，通过通用引物进行双向反应测序，将测定的核苷酸序列与基因库中原有的序列比较分析。　　将测序正确的pIRES2-eGFP/mGITRL质粒的DH5α菌株大量扩增，并严格按照Axygen试剂盒里说明书抽提质粒，同时抽提pIRES2-eGFP质粒以作为阴性对照。　　1.4LeGITRL

8、及pIRES2-eGFP(对照组质粒)分别转染Lewis细胞。状态良好的Lewis细胞4.0×106，加入质粒15μg，无血清1640培养基调整体积为300μl并接种于电转杯中，冰上放置5min后电转仪电击（0.22kV，960μf），转染后细胞接种于6孔板中培养，48h后加入800μg/mlG418,