hgitraa1165igg1fc真核表达质粒的构建及其表达

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1、hGITRaa1165IgG1Fc真核表达质粒的构建及其表达：崔大伟王胜军陈君仝佳陈建国，王海生杨先知史烨许化溪邵启祥【摘要】目的：构建含有人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）胞外段基因的真核表达质粒hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)，检测hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白在真核细胞COS7中的表达。方法：以pGEMTGITR质粒为模板，通过PCR扩增获得人GITR胞外段的基因hGITRaa1165，将该目的基因连接至IgG1FcpcDNA3.1(+)质粒，构建hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(

2、+)真核表达质粒。将该重组质粒采用脂质体法转染COS7细胞，通过SDSPAGE和蛋白质印迹法检测hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白在真核细胞COS7中的表达。结果：成功构建真核表达质粒hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)，并在其转染的COS7细胞培养上清中检测到hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白的表达。结论：成功表达hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白，为进一步研究GITR的生物学功能奠定了基础。【关键词】糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体；COS7细胞；真核表达［Abstract］Objective:Tocon

3、structedrebinanteukaryoticplasmidhGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+),thentoexpressthefusionproteinhGITRaa1165IgG1FcinCOS7cells.Methods：ThehGITRaa1165geneplificationfromthepGEMTGITRvectorandinsertedintothevectorhIgG1FcpcDNA3.1(+).TheCOS7cellsediationofliposomemixedornecrosisfactorreceptor(G

4、ITR)；COS7cells；eukaryoticexpression人类糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（humanglucocorticoidinducedtumornecrosisfactorreceptor，hGITR），也被称为TNFRSF18。天然CD4+CD25+Treg细胞组成性高表达GITR，而静止T细胞低水平表达，其膜表达量会随着T细胞的激活而增加［1，2］。GITR与其配体(GITRL)的相互作用与自身免疫疾病、慢性感染、抗肿瘤免疫等相关。GITR与GITRL结合后，可呈现增强效应T细胞的活化和取消Treg细胞的抑制功能的特点［3］。因此,关于GITR与

5、GITRL相互作用的机制及其在肿瘤免疫，机体炎症及某些自身免疫疾病中的作用有待于更深入的研究。本研究成功克隆人GITR胞外区基因,构建GITRaa1165IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体,并在COS7细胞中获得功能性表达,为进一步研究GITR的生物学功能奠定了良好的基础。1材料和方法1.1材料ExTaqDNA聚合酶、高GC缓冲液I（Takara公司），梭华SofastTM脂质体（厦门太阳马生物工程有限公司），ECL发光试剂盒（GE.Healthcare公司），HRP羊抗小鼠IgG（美国KPL公司），CCK8试剂盒（DOJINDO公司）。质粒hIgG1FcpcDNA

6、3.1(+)由华中科技大学同济医学院免疫教研室吴雄文教授惠赠。pGEMThGITR，pIRES2eGFP，小鼠抗人GITR多克隆抗体，COS7,HUEVC,THP1细胞株由本室保存。1.2方法1.2.1PCR引物的设计根据基因库中人GITR基因（序列号为AY358877）胞外段序列（hGITRaa1165）以及质粒hIgG1FcpcDNA3.1(+)多克隆位点［hIgG1Fc段已经插入pcDNA3.1(+)载体的EcoRI与XhoI位点之间］,通过PrimerPremier5.0软件设计特异性引物,由上海生工生物工程技术有限公司合成。正链引物F1（5′端加HindⅢ酶

7、切位点），序列为：5′CCTAAGCTTATGGCACAGCACGGGGCGAT3′；反链引物R1（5′端加BamHI酶切位点），序列为：5′GTCCTAGGCCACCCAAGCGGCTCTGC3′。同样，根据质粒hIgG1FcpcDNA3.1(+)多克隆位点及eGFP基因序列，设计eGFP对照引物：正链引物F2（5′端加HindⅢ酶切位点），序列为:5′ATTAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAG3′；反链引物R2（5′端加BamHI酶切位点），序列为：