皮蝇素基因真核表达质粒的构建及其免疫特性的研究

《皮蝇素基因真核表达质粒的构建及其免疫特性的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号S851.7学校代码10129UDC11.220学号2009201071皮蝇素基因真核表达质粒的构建及其免疫特性的研究ConstructionandImmunCharacteristicsStudyofEukaryoticExpressionVectorofHypoderminsGene申请人：白红岩学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：兽医寄生虫病及防治指导教师：呼和巴特尔教授论文提交日期：二〇一二年五月摘要牛皮蝇蛆病主要是牛皮蝇和纹皮蝇的幼虫寄生在牛体内引起的一种寄生虫病。该病危害很严重，对养牛业和皮革加工业有着非常大的影响，而且妨碍公共卫生引发人畜共患病，现

2、行的药物防治方法存在副作用，畜产品药物残留等缺点。因此人们越来越重视该病的免疫防治研究。本研究以重组克隆载体pTHA和pTHC为模板，利用PCR技术和重叠延伸剪接技术，扩增HA-HC融合基因，连接到克隆载体pMD19-Tsimplevector中，构建重组克隆质粒pMD19-T-HAC（简称pTHAC）。将HA、HC、HA-HC基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中，构建重组真核表达质粒pVAX1-HA(简称pVHA)、pVAX1-HC（简称pVHC）和pVAX1-HAC(简称pVHAC)。将各重组质粒体外转染小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞，检测目的基因的瞬时表达情况。在

3、体内将各重组表达质粒和空载体pVAX1及PBS免疫昆明小鼠，共免疫3次，每次间隔2周，采8次血清，应用间接ELISA方法检测血清抗体效价。第3次免疫2周后，以纹皮蝇重组蛋白为刺激原，MTT法检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况；再以γ干扰素酶联免疫分析试剂盒检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌的IFN-γ含量。结果表明：与空载体pVAX1和PBS对照组相比，各重组表达质粒免疫组小鼠的抗体水平逐渐上升，差异极显著（P﹤0.01）。第3次免疫2周后，DNA疫苗免疫组的淋巴细胞增殖试验刺激值（SI）高于对照组，差异极显著（P﹤0.01）；双价DNA疫苗组的刺激值高于单价DNA疫苗pVHC组，低于单价D

4、NA疫苗pVHA组，差异极显著（P﹤0.01）。DNA疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ高于两个对照组，差异极显著（P﹤0.01）。不论是单价DNA疫苗，还是双价DNA疫苗，在小鼠体内均能诱导体液免疫和细胞免疫应答，本实验为牛皮蝇蛆病新型疫苗的研究奠定了基础。关键词：牛皮蝇蛆病；真核表达质粒；构建；免疫ConstructionandImmunCharacteristicsStudyofEukaryoticExpressionVectorofHypoderminsGeneAbstractHypodermosisisaparasiticdiseasecausedbytheH

5、ypodermalarvaeyurnintothesubcutaneoustissue.Theharmisvaryserious,hasaverylargeimpactonthecattleindustryandleatherindustryandpreventthepublichealthcausedbyzoonoses.Thereisagrowingemphasisondiseasepreventionandcontrolresearch.Inthepresentstudy,theDNAfragmentsofHA-HCwereamplifiedbyPCRandsplice

6、dbyoverlappingextensionfromthegenomeDNAofrecombinantcloningvectorspTHAandpTHC,andthefragmentwasligatedintopMD19-TsimplevectortocontructrecombinantcloningpTHAC.HA、HC、HACgenesweresubclonedintopVAX1vectortoconstructrecombinantplasmidspVHA、pVHCandpVHAC.Thethreeplasmidsweretransfectedintothemice

7、embryonicfibroblasts(MEF)andthebovineembryonicfibroblastsinvitrotodetecttheexpressionoftargetgenes.KunMingmisewereintranmuscularlyvaccinatedwiththefoureplamids(pVHA、pVHC、pVHAC、pVHA+pVHC)andthecontrolvectorpVAX1andPBSrespectively.Theanimalsineachgroupwere