hpv16 l1真核表达质粒的构建及其免疫小鼠特

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1、HPV16L1真核表达质粒的构建及其免疫小鼠特【摘要】　　目的探讨HPV16型L1基因片段免疫小鼠的作用，以期为HPV16预防疫苗的研制奠定基础。方法利用基因工程技术构建HPV16L1真核表达质粒pcDNA3-HPV16L1，在证明该构建系统能在真核细胞7721中有效表达后，用此质粒肌内注射免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测小鼠血清相应抗体。结果pcDNA3-HPV16L1质粒DNA能在小鼠体内表达并诱导产生HPV16型特异性抗体。结论HPV16L1基因片段可诱导机体产生特异性抗体，为HPV核酸疫苗的研究奠定了理论和实验基础。【关键词】乳头瘤病毒；人；克隆；分子；疫苗；小鼠　

2、　人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）是一类严重威胁人类健康的DNA肿瘤病毒，高危型人乳头瘤病毒HPV16的感染与宫颈癌的关系已被流行病学、组织病理学和分子生物学的众多证据所证明。研究发现在真核或原核细胞中表达的HPV16主要衣壳蛋白（L1）具有自身装配成病毒样颗粒（Virus-likeparticles，VLP）的特性［1］,与天然的病毒颗粒具有相似的结构，有很强的免疫原性和免疫综合性，可以刺激机体产生中和性抗体IgG、IgA［2］,能保护动物免受相同型别HPV的攻击，是目前疫苗构建中常用的保护性抗原，与重组腺病毒疫苗相比，DNA疫苗具有制备简单有效的

3、特性，是有广泛用应前景的第3代疫苗。因此本实验构建了HPV16主衣壳蛋白（L1）的真核表达质粒，在充分证明其在哺乳动物细胞中能有效表达HPV16L1蛋白的基础上，进一步研究重组真核表达质粒的免疫原性，以探讨研制可预防HPV16感染的核酸疫苗的可行性及有效性。　　1材料　　1.1质粒、菌种和细胞株质粒p16L1BN1（含HPV16L1全长基因，由于修平教授构建惠赠），真核表达载体pcDNA3.0（含CMV启动子）、大肠杆菌DH5α及TA克隆载体pMD18-T（大连宝生物公司产品）；7721人肝癌细胞株购于中国科学院上海细胞所。　　1.2试剂限制性内切酶BamHI，HindIII，X

4、balI，T4连接酶，DNAMarkerλ-EcoT141，DNAMarkerλ-HindIII及PCR扩增试剂盒均为大连宝生物公司产品；质粒提纯及酶切片段回收试剂盒为Qiagen公司产品。Lipofectamine2000Reagent，胎牛血清，RPMI1640购自GIBCO公司。G418购自上海生工生物工程有限公司。鼠抗HPV16L1单克隆抗体由卞继峰博士（山东医科大学分子生物学实验室）提供，羊抗鼠IgG-HRP和TMB购自北京中山生物公司。低分子量标准蛋白质为Pharmacia公司产品。HPV16VLPs由美国癌症研究中心Schiller教授惠赠。　　1.3动物BALB/

5、c小鼠，雌性，4～6周龄，体质量（20±2）g，购自华中科技大学同济医学院实验动物学部。　　2方法　　2.1PCR扩增目的片段　　特异性引物P1、P2序列如下：P1：GCAAGATCTATGTCTCTTTGGCTGCCTAGT；P2：AGCAGATCTTTACAGCTTACGTTTTTTGCG上下游引物前各加入BglII内切酶识别序列（画线部分）。以质粒p16L1BN1为模板，按照94℃变性3min，然后94℃45s，60℃45s，72℃1.5min，循环30个周期后，72℃延伸7min，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。　　2.2HPV16L1T-A克隆构建　　PCR产物3’端多

6、出的A碱基与载体pMD18-T的5’端的T碱基互补，于16℃连接过夜，以常规CaCl2法转化感受态DH5α，在含有氨苄的LB平板上37℃培养过夜筛选阳性菌落，BamHI单酶切鉴定重组子pT-A16L1。　　2.3HPV16L1真核表达质粒pcDNA3-HPV16L1的构建　　重组体pT-A16L1经HindIII，XbalI双酶切，回收HPV16L1片段（约1.52kb）。真核表达载体pcDNA3.0同样经HindIII，XbalI双酶切回收，与回收的HPV16L1片段以1∶3的摩尔比混合，16℃连接过夜，转化感受态DH5α，在含有氨苄的LB平板上37℃培养过夜筛选阳性菌落。Hi

7、ndIII，XbalI双酶切鉴定重组质粒pcDNA3-HPV16L1，同时进行克隆片段全长测序（上海生工生物工程有限公司完成），以检查重组质粒中克隆片段核苷酸序列的改变情况。　　2.4细胞转染及筛选将7721人肝癌细胞株接种于6孔板中，37℃5%CO2条件下培养至80%汇合时，用脂质体转染的方法分别导入经PEG法纯化的质粒pcDNA3-HPV16L1和空载体pcDNA3.0，在含有G418的RPMI1640中培养48h，筛选阳性转化细胞，G418的有效浓度为400μg·ml-1。