小鼠nf-κb p65 亚基真核表达质粒的构建

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1、小鼠NF-κBp65亚基真核表达质粒的构建#鲍斌，杨雪梅，刘健**（合肥工业大学生物与食品工程学院）5101520253035摘要：作为一种代谢疾病，肥胖正在全球广泛蔓延，威胁人类健康。最新的研究表明，肥胖是一种复杂的慢性低度炎性。巨噬细胞在脂肪沉积的过程中首先浸润到脂肪组织，直接参与到了相关炎性反应中。NF-κB的激活与巨噬细胞所介导的炎性密切相关，p65亚基是NF-κB信号调控下游靶基因转录的重要因子。构建p65的真核表达质粒可以为后续在脂肪组织巨噬细胞中研究NF-κB信号通路的调控奠定基础。因此，本研究利用PCR技术扩增了p65基因，然后构建了p65的真核表

2、达质粒（p65-EGFP），并通过PCR验证和酶切验证了重组质粒的正确性。最后提取不含内毒素的质粒，转染HepG2细胞，通过观测绿色荧光检测转染效率。p65-EGFP重组质粒的成功构建为后续开展巨噬细胞NF-kB信号通路的研究奠定了基础。关键词：分子生物学；NF-kB;p65；重组质粒；真核表达中图分类号：Q786ConstructionofmouseNF-κBp65subunitexpressionplasmidsBAOBin,YANGXuemei,LIUJian(SchoolofBiotechnologyandFoodEngineering,HefeiUnivers

3、ityofTechnology)Abstract:Asakindofmetabolicdisease,obesityisglobllyspreading,threateninghumanhealth.Recentresearchsshowthatobesityisakindoflowchronicinflammatoryreaction.Asanimportantimmunecells,macrophagesfirstlyinfiltratedintotheadiposetissueintheprocessoffatdeposition,anddirectlyinvol

4、vedintherelatedinflammatoryreaction.Inmacrophages,NF-κBactivationiscloselyrelatedtotheriseofinflammatory,andp65isquiteimportantintheregulationoftargetgenestranscription.Construtingthep65eukaryoticexpressionplasmidcanpromotethefollow-upstudyofNF-kappaBsignalingpathwaysinmacrophagesinadipo

5、setissues.Inthisstudy,weamplifiedp65withPCR,andthenconstructsthep65ofeukaryoticexpressionplasmid(p65-pEGFP-C1).ThentherecombinantplasmidisvalidatedbyenzymedigestionandPCRtoverifythevalidity.Finally,weextracttherecombinantplasmid,withoutendotoxin,andthentransfectittoHepG2cells.Thetransfec

6、tionefficiencywasdetectedbyobservingthegreenfluorescence.Thesuccessofreorganizationoftherecombinantplasmid(p65-pEGFP-C1)canmakegreatcontributiontothesubsequentresearchwhichisimportanttounderstandthemechanismoftheNF-kBsignalingpathwayinmacrophagesinadiposetissues.Keywords:MolecularBiology

7、;NF-kB;p65;Recombinantplasmid;Eukaryoticexpression0引言近年来，随着对肥胖诱导的慢性炎性的深入研究，其可能的发生机制正在逐渐被阐明[1-2]。脂肪组织慢性炎症的发生涉及脂肪细胞肥大、巨噬细胞浸润、组织局部缺氧和内质网应激等。其中巨噬细胞在诱导脂肪细胞分解释放饱和脂肪酸，进而激活炎性反应的过程中起了重要作用[3-5]。巨噬细胞存在两种激活方式：LPS和INFλ激活的经典激活状态（M1），IL-440和IL13所激活的替代型激活状态（M2）。肥胖过程中，脂肪沉积位置以及营养状态会导致脂