atp7b重组真核表达质粒治疗tx小鼠的实验的研究及adatp7b的构建

《atp7b重组真核表达质粒治疗tx小鼠的实验的研究及adatp7b的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、ATP7B重组真核表达质粒治疗TX小鼠的实验研究壁—Ad—-垒!!!璺塑塑堡ATP7B重组真核表达质粒治疗TX小鼠的实验研究及Ad-ATP7B的构建博士研究生：汤其强导师：梁秀龄教授中山大学附属第一医院神经内科广州(510080)摘要Wilson病(Wilson7sdisease，WD)，又称为肝豆状核变性(hepatolenticulardegeneration，HLD)，是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病。由于铜离子在体内蓄积造成肝脏和脑部为主的全身性病理损害。导致以肝脏和神经系统症状为主的复杂的临床表现，以角膜色素环(Kayser．Fleische

2、rring，K．F环)最具特征性。其生化特征是血清铜蓝蛋白(ceruloplasmin．CP)降低和胆道排铜障碍。WD是一种单基因遗传病．据本科门诊统计该病位居单基因遗传病的第二位。WD致病基因定位于D13q14．3，外显子全长为4398bp，编码蛋白为P型ATP酶，多肽链长1465AA，命名为ATP7B。现己明确WD基因全长约80Kb，含21个外显子及20个内含子。目前WD的治疗方法包括：①金属络合剂为主的驱铜对症治疗，②锌剂治疗，③肝移植尤其原位肝移植治疗。但这些治疗方法均不甚理想，而WD作为单基因遗传病，最理想的治疗当属基因治疗。基因治疗是指以遗传学原

3、理及基因工程技术为基础，在基因水平修补，矫正，替代缺陷基因或调控其表达的治疗方法。目前应用较多的单基因遗传病基因治疗载体是真核表达质粒和病毒载体。真核表达质粒具有构建相对简单，可在细菌内快速大量扩增等优点。腺病毒载体进入宿主细胞核后以附加体形式存在，不整合进宿主基因组，不存在随机插入的不安全性问题，同时又能高效表达，故WD基因治疗应用腺病毒载体或真核表达质粒较为ATP7B重组真核表达质粒治疗TX小鼠的实验研究及Ad—ATP7B的构建合适。国内尚未开展WD的基因治疗研究。Wilson病是我国单基因神经遗传病研究得最深入的』L个病种之一。本课题组存梁秀龄教授带领

4、下于二十世纪八十年代初丌始了对wD的系列研究。并首次在国内引进了目前常用的WD的动物模型一Tx小鼠，该小鼠的遗传背景已明确：其致病基因为atp7b，定位于第8号染色体，突变形式为Mell356Val，该位点在第8跨膜区，其mRNA转录水平无明显改变。编码蛋白与人ATP7B蛋白的同源性为58％。也表现为肝内铜大量沉积、血清铜和铜蓝蛋白水平下降等。本研究的目的和意义目前对WD的治疗采用青霉胺等金属络合剂、锌剂、低铜饮食等对症治疗，减少铜的摄入并促进其排出。由于这些只是对症治疗，故患者须终生治疗，且青霉胺等金属络合剂常出现严重的毒副作用而使患者被迫中断治疗。而原位

5、肝移植治疗由于存在难以避免强烈的免疫排斥反应，供肝来源有限，治疗费用昂贵等渚多问题，只能解决部分患者的治疗问题。WD致病基因ATP7B的定位和克隆为WD的基因治疗奠定了初步的基础。本实验在本课题组既往研究的基础上，在国内率先开展WD基因治疗的初步研究和探讨。鉴于ATP7BcDNA长达4．4kb，构建重组腺病毒难度较大，故先构建ATP7B重组真核表达质粒，进行离体和在体水平的基因治疗研究探索，然后进行重组腺病毒的构建，为下一步重组腺病毒的基因治疗刨造条件。内容包括：1．构建ATP7B基因的重组真核表达质粒pcDNA3．1(+)／ATP7B。2．进行TX小鼠体外

6、皮肤成纤维细胞的培养并进行pcDNA3．1(+)／ATP7B在细胞水平基因治疗的初步研究。3．以重组真核表达质粒pcDNA3．0／ATP7B进行TX小鼠基因治疗的初步研究。4．构建ATP7B基因的重组腺病毒载体Ad．ATP7B。第一章重组真核表达质粒pcDNA3．1(+)／ATP7B的构建实验方法将pRC／CMV-ATP7B和pcDNA3．1(+)以Xbal和BamHl双酶切后的ATP7B重组真核表达质粒治疗TX小鼠的实验研究及Ad．ATP7B的构建ATP7BcDNA片段和线性化的pcDNA3．1(+)连接，定向克隆构建pcDNA3．1(+)／ATP7B。挑

7、取阳性克隆进行PCR鉴定和酶切鉴定。并进行ATP7BcDNA的全序列测序。实验结果PCR及酶切鉴定均证实重组真核表达质粒pcDNA3．1(+)／ATP7B的构建成功。ATP7BcDNA的全序列测序发现3个错义突变点，但造成的氨基酸改变不在ATP7B蛋白的高度保守区。结论本研究对重组真核表达质粒peDNA3．1(+)／ATP7B的构建获得成功。第二章pcDNA3．I(+)IATP7B对'IX小藐浅纤维细胞模鳖镳筏落影响实验方法先随机选取4月龄的TX小鼠(WD动物模型)和DL小鼠(正常对照小鼠)各lO只，蠛雄比例相同。以腹部皮肤进萼亍戏纾维缨腿的{本终培养，溪《

8、定其镪，蛋白比慎(cu／p，ng／mg)以确定TX小