反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定

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1、反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定许朱定，宋振顺，安家泽，李韧，张福琴，窦科峰【关键词】,基因表达Constructionandidentificationofrebinanteukaryoticexpressionvectorofhumanantisensecorticalactinassociatedproteingene　　【Abstract】AIM:ToconstructarebinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.0/cortactincontainingfunctionalregionofhuma

2、nantisensecorticalactinassociatedproteingene(cortactin),soastoprovideatoolforthefurtherstudyontheimpactofcortactininhepatocellularcarcinoma(HCC)metastasis.METHODS:TotalRNAethodfromcelllineMHCC97.CDNAplifiedusingreversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR).ProductofPCR,amplified

3、bybeingtransformedintoE.coliDh5α,edthatcortactincDNAetastaticHCCcelllineMHCC97;reversetranscriptasepolymerasechainreaction;humancorticalactinassociatedprotein(cortactin)　　【摘要】目的：构建一个包含人皮层肌动蛋白（cortactin）反义基因的全部功能区的重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin，为进一步研究人皮层肌动蛋白对人肝癌细胞的转移影响的研究奠定基础.方法：Trizol试剂法

4、提取体外培养的人肝癌高转移细胞株MHCC97总RNA，经逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）扩增目的片段，PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接，并转化入大肠杆菌Ecoli.Dh5α扩增以获得重组载体.结果：RTPCR获得预期大小的特异性DNA片段，经PCR、双酶切鉴定及测序证实已将人皮层肌动蛋白基因cDNA片段正确的反向插入真核表达载体中.结论：成功获得反义pcDNA3.0/cortactin重组质粒.　　【关键词】基因表达；高转移肝癌细胞MHCC97；逆转录聚合酶链反应；人皮层肌动蛋白cortactin　　0引言　　原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,

5、其侵袭转移和术后复发是患者死亡的主要原因.目前国内外对肝癌转移机制研究逐步深入.最近人们发现人皮层肌动蛋白cortactin基因对于肿癌的转移有重要的促进作用.为此，我们利用反义核酸技术构建真核表达载体pcDNA3.0/cortactin，为后续的研究将该基因片段转染入肝癌细胞株，观察该基因在肝癌细胞株中的表达情况，并对转染后的细胞功能进行研究作好准备.　　1材料和方法　　1.1材料高转移肝癌细胞MHCC97购自上海复旦大学中山医院肝癌研究所；大肠杆菌Ecoli.Dh5α，真核表达载体pcDNA3.0由第四军医大学分子生物学教研室吴元明博士惠赠.高糖型DMEM培

6、养液为Invitrogen公司产品；新生牛血清系北京元亨圣马生物技术研究所产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料技术有限公司产品；胰蛋白酶(Trypsin)为北京原平皓生物技术有限公司产品；胰蛋白胨(Tryptone)及酵母提取液（YeastExtract）为OXLID公司产品；琼脂（Agar）为Sanland公司产品；琼脂糖（Agarose）为上海Yito公司产品；Trizol试剂、Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶（XhoI,BamHI）、pMD18T载体、Trizol试剂为Takana公司产品；胶回收试剂盒为BioDev公司产品；质粒小量抽提试剂盒为

7、Vgene公司.PCR引物：根据GeneBank中查到的cortactin的mRNA序列，用软件PrimerPremier5.0设计上下游引物，引物序列如下（划线部分分别是BamHI和XhoI的碱基识别序列，斜体部分为保护序列）：上游引物5＇ATACTCGAGGTGGAACAAGACCGAATGGA3＇；下游引物5＇TAGGATCCATCCCAGCCAAGGGCACATT3＇.　　1.2方法　　1.2.1高转移肝癌细胞MHCC97培养将购回的细胞经2.5g/L胰蛋白酶消化传代，培养于含100mL/L胎牛血清的高糖型DMEM完全培养液中，置于37℃含50mL/LC

8、O2的孵箱中培养，每3d