杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

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1、杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达作者：李金福,陈建平,杨志伟,田玉,马莹,胡孝素【关键词】杜氏利什曼原虫;,无鞭毛体蛋白基因;,体外表达　　ConstructionandexpressionofrecombinanteucaryoticexpressionplasmidofamastingeneofLeishmaniaDonovani　　[Abstract]AIM:ToconstructrecombinanteukaryoticexpressionplasmidofamastingeneofLeishmaniaDonovani

2、anddetectexpressionofthegeneinNIH3T3cells.METHODS:AmastingenewasamplifiedfromnuclearDNAofLeishmaniaDonovaniisolatesandclonedintoaneukaryoticexpressionvectorpcDNA31(+).TherecombinantplasmidwasnamedpcDNA31amastin.NIH3T3cellwastransfectedbypcDNA31amastin.Transientandstableexpression

3、ofamastingeneweredetectedbyimmunofluoresenceandRTPCR.RESULTS:Itwasfoundthattherewashighgreenfluorescenceonthecellmembraneandinsidethecell.ItshowedthatNIH3T3cellwastransfectedbypcDNA31amastinsuccessfully.CONCLUSION:ArecombinanteukaryoticexpressionplasmidofamastingeneofLeishmania13

4、Donovaniwassuccessfullyconstructed,andcanbeexpressedstablyintheNIH3T3cells.　　[Keywords]LeishmaniaDonovani;amastingene;expressinvitro　　[摘要]目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA31amastin,并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA31(+)中,构建真核表达重组质粒pcD

5、NA31amastin。以pcDNA31amastin转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光染色法和RTPCR分别鉴定pcDNA31amastin的瞬时表达和稳定表达。结果:在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA31amastin成功地转入NIH3T3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后,用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因,表明获得了稳定表达。结论:成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒,并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。　　[关键词]杜氏利什曼原虫;无鞭毛体蛋白基因

6、;体外表达　　杜氏利什曼原虫是一种胞内寄生原虫,由媒介昆虫白蛉传播,13其引起的黑热病致死率极高,WHO/TDR已将其列为6种重点防治的热带病之一。因现有疫苗效果不够理想,目前尚无可大规模用于临床的黑热病预防接种疫苗。因而,寻找有效的、新的黑热病疫苗候选分子已成为当今黑热病预防研究工作的重点。近年来,对无鞭毛体蛋白(amastin)的研究[1,2]使其有望成为一种黑热病疫苗的候选分子。本研究根据GenBank中登录的4种利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的序列,自行设计引物,克隆了杜氏利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因,并将其导入质粒pcDNA31(+)中,构

7、建了真核表达重组质粒pcDNA31amastin,并在NIH3T3细胞中获得稳定表达,为进一步构建黑热病无鞭毛体蛋白基因疫苗奠定了基础。　　1材料和方法　　1.1材料杜氏利什曼原虫四川省汶川县人分离株(MHOM/CN/90/SC10H2)及NIH3T3细胞均由本室保存。限制性内切酶BamHI和XhoI为Fermentas公司产品。PCR扩增所用聚合酶PremixExTaq为宝生物工程（大连）有限公司产品。胶回收试剂盒为BioerTechnology公司产品。质粒小量提取试剂盒为Omega公司产品。T4DNA连接酶为NewEnglandLabs公司产品。兔

8、抗杜氏利什曼原虫血清由本室自行制备,FITC标记的羊抗兔抗体为北京成文免疫化学研