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1、杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达论文.freelidofamastingeneofLeishmaniaDonovaniAbstractAIM:ToconstructrebinanteukaryoticexpressionplasmidofamastingeneofLeishmaniaDonovanianddetectexpressionofthegeneinNIH3T3cells.METHODS:AmastingeneplifiedfromnuclearDNAofLeishmaniaDonovaniisolatesandclone
2、dintoaneukaryoticexpressionvectorpcDNA31(+).TherebinantplasmidedpcDNA31amastin.NIH3T3cellastin.TransientandstableexpressionofamastingenemunofluoresenceandRTPCR.RESULTS:Itembraneandinsidethecell.Itshoastinsuccessfully.CONCLUSION:ArebinanteukaryoticexpressionplasmidofamastingeneofLei
3、shmaniaDonovanianiaDonovani;amastingene;expressinvitro摘要目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA31amastin,并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA31(+)中,构建真核表达重组质粒pcDNA31amastin。以pcDNA31amastin转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光染色法和RTPCR分别鉴定pcDNA31amastin的瞬时表达和稳定表达。结果
4、:在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA31amastin成功地转入NIH3T3细胞,.freelastin)的研究1,2使其有望成为一种黑热病疫苗的候选分子。本研究根据GenBank中登录的4种利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的序列,自行设计引物,克隆了杜氏利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因,并将其导入质粒pcDNA31(+)中,构建了真核表达重组质粒pcDNA31amastin,并在NIH3T3细胞中获得稳定表达,为进一步构建黑热病无鞭毛体蛋白基因疫苗奠定了基础。1材料和方法1.1材料杜氏利什曼原虫四川省汶川县人分离株(MHOM//90/SC
5、10H2)及NIH3T3细胞均由本室保存。限制性内切酶BamHI和XhoI为Fermentas公司产品。PCR扩增所用聚合酶PremixExTaq为宝生物工程（大连）有限公司产品。胶回收试剂盒为BioerTechnology公司产品。质粒小量提取试剂盒为Omega公司产品。T4DNA连接酶为NeL/L小牛血清的M199培养液中进行扩大培养。当虫体总数达5×109～1×1010时收集虫体,参照文献3的方法略加修改提取虫体基因组DNA。1.2.2PCR引物的设计和合成根据GenBank中登录的4种利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的序列设计一对引物,在上游引物P1的
6、5′端添加BamHI识别序列和保护序列,在下游引物P2的5′端添加XhoI识别序列和保护序列。引物的合成由宝生物工程（大连）有限公司完成。引物的序列如下:P1:5′GGCGGATCCATGCTGTGCTCGTGCATCGTGTT3′（划线处为BamHI酶切位点）;P2:5′CGCCTCGAGCTACATTATAATCAGCAGCACCAGG3′（划线处为XhoI酶切位点）。1.2.3无鞭毛体蛋白基因的扩增PCR反应条件为94℃预变性3min,然后94℃变性30s,60℃退火40s,72℃延伸40s,共30个循环,最后1个循环后于72℃再延伸10min。扩增产
7、物经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.4无鞭毛体蛋白基因的克隆将上述PCR产物、质粒载体pcDNA31(+)分别以BamHI和XhoI双酶切,经胶回收试剂盒纯化酶切后的产物,并用T4DNA连接酶将无鞭毛体蛋白基因片段与质粒pcDNA31(+)相连接。取连接产物转化预先制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞,将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平皿上,于37℃培养16h。1.2.5重组质粒的PCR筛选与鉴定从上述LB平皿上,随机挑取数个菌落分别接种入含有氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中,于37℃剧烈振摇培养过夜。以P1、P2为引物,从各管中分别取1～2μL
8、菌液直接进行PCR。扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电
