重组铜绿假单胞菌外毒素A和pcrV基因质粒的构建及真核表达.pdf

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1、·694·医学研究生学报2014年7月第27卷第7期J憧P。丝：Z：：2：坚z论著(基础研究)重组铜绿假单胞菌外毒素A和pcrV基因质粒的构建及真核表达姜明子，冯旰珠【摘要】目的外毒素A(toxA基因编码)是铜绿假单胞菌毒力最强的因子之一，PcrV(pcrV基因编码)是铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的关键调控因子之一。文中旨在构建重组toxA和pcrV基因的铜绿假单胞菌核酸疫苗，并在HEK-293细胞中表达目的蛋白。方法PCR法从铜绿假单胞菌基因组基因中扩增出toxA和pcrV基因，点突变法对toxA基因进行减毒优化，随后将突变的to

2、xA基因和pcrV基因分别插入plRES真核表达质粒的2个多克隆位点，构建真核双表达重组质粒pIRES-toxA-pcrV。脂质体法将plRES—toxA一pcrV瞬时转染人HEK-293细胞，通过Westernblot检测toxA及pcrV在真核细胞中的表达。结果构建的真核表达质粒pIRES．toxA．pcrV，经脂质体转染HEK-293细胞后，在其细胞内检测到目的蛋白的表达。结论成功构建plRES．toxA．pcrV表达载体并在转染的真核细胞中得以有效的表达，为研究铜绿假单胞菌预防性疫苗奠定了实验基础。[关键词】铜绿假单胞菌

3、I夕毒素A；核酸疫苗；pcrV基因[中图分类号】R563[文献标志码】A[文章编号】1008-8199(2014)07-0694-04ConstructionandeukaryoticexpressionofarecombinantplasmidencodingPseudomonasaeruginosatoxAandtypeⅢsecretionsystempcrVJIANGMing—zi，FENGGan—zhu(DepartmentofRespiratory，theSecondAffiliatedHospitalofNanjin

4、gMedicalUniversity，Nanjing210011，Jiangsu，China)[Abstract]ObjectiveExotoxinA(encodedbygenetoxA)，oneofthemosttoxicproteinsecretedbypseudomonasaerugi—nosa(P．a．)，andPcrV(encodedbygenepcrV)，keycomponenttotypemsecretionsystemofP．a．，bothmattersignificantlytothevirulenceofP．

5、a．ThearticlewastoconstructanovelDNAvaccineencodingamutatedtoxAgeneandthepcrVgeneofP．a．andi-dentifygeneexpressionsineukaryotiecells．MethodsThegenesoftoxAandpcrVwereamplifiedbyPCR，andthetoxAgenewasmutatedtoreducethetoxicityofExotoxinA．ThengenefragmentstoxAandpcrVwerein

6、sertedintoeukaryoticexpressionplasmidpIRESsimultaneouslytoconstructarecombinantDNAvaccinepIRES-toxAm-pcrV．ThenovelplasmidwastransfectedintoHEK-293．cellsbylipofectamine2000．TheexpressionsoftoxAandpcrVweredetectedbyWesternblot．ResultsGelelectrophoresisdemon-stratedthet

7、argetgenefragmentsencodingExotoxinAandPcrV．WesternblotexhibitedproteinsencodedtoxAandpcrVexpressedbyHEK293cells．ConclusionTherecombinantplasmidpIRES—toxAm-pcrVwassuccessfullyconstructed．Westernblotanalysisindi—catedtheexpressionsoftoxAandpcrVinHEK-293cells．Itmaybeuse

8、dasapotentialcandidateofpreventivevaccineofPseudo—monasaeruginosa．[Keywords]Pseudomonasaemginosa；ExotoxinA；DNAvaccine；PcrV0引言铜绿假单胞菌