资源描述：
《铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达【摘要】目的克隆铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体，为进一步研究这七种含Pilz结构域蛋白是否为第二信使c-di-GMP潜在的受体分子奠定实验基础。方法提取铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA,用PCR方法从中扩增出七种功能未知的含Pilz结构域蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。结果成功扩增出七种含Pi
2、lz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,测序结果与NCBI数据库收录序列相一致。SDS-PAGE检验证明目的基因在大肠杆菌BL21中获得高效表达。结论从铜绿假单胞菌基因组中成功地克隆了七种含Pilz结构域蛋白基因，其构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。【关键词】铜绿假单胞菌;c-di-GMP第二信使;Pilz结构域蛋白;基因克隆;原核表达载体构建 铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa),又称绿脓杆菌,是临床感染性疾病中常见的条件致病菌之一。该菌致病机制复杂而多样,其固有
3、的对抗生素和消毒剂的耐受性使治疗十分困难。铜绿假单胞菌全基因组测序的完成[1],8特别是近几年环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)对细菌生物学功能调控作用的突破性研究进展,使得我们在分子水平上深入探讨其耐药机理,在信号途径的研究中寻找新的作用靶点成为了可能。作为一种广泛存在于细菌中的新型的第二信使,c-di-GMP参与调控了多种细菌生物学功能，如细菌的运动性、生物膜合成、细菌毒性及细菌的群体感应等[2]，但其作用机制尚不完全清楚。铜绿假单胞菌全基因组共有5,670个基因,利用生物信息学手段，在其全基因组中发现了八
4、种编码Pilz结构域(Pfam07238)蛋白基因。与胞外多糖海藻酸钠合成有关的Alg44(PA3542)蛋白已被实验证明为c-di-GMP的受体分子,其余七种蛋白功能未知。为了鉴定这七种含Pilz结构域蛋白是否为c-di-GMP潜在的受体分子,我们对其基因进行了克隆并尝试构建它们的原核表达载体,旨在为今后铜绿假单胞菌基因-表型-致病性的体外研究以及c-di-GMP信号通路的深入研究提供实验材料。 1材料和方法 1.1材料铜绿假单胞菌PAO1、pET32a载体以及原核表达宿主菌BL21(DE3)由本室保存
5、;蛋白酶K购自德国Merck公司;限制性内切酶BamH1和HindⅢ购自NewEnglandBiolabs公司;PfuDNA聚合酶和T4DNA连接酶均购自Fermentas公司;IPTG为Sigma公司产品。 1.2铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA的制备铜绿假单胞菌标准株PAO1在LB琼脂平板上划线纯化,挑取单克隆,接种于15mL8LB培养基中,37°C旋转培养过夜。3000g,10min离心收集细胞,TE(pH8.0)洗涤2次,并重新悬浮于5mL的TE缓冲液中,加入250μL20%SDS溶液,轻轻地颠倒几
6、次裂解细胞。然后加入50μL的20mg·mL-1蛋白酶K,37°C作用1h。消化完成后,加入等体积的Tris饱和酚,轻轻混匀后于10000g离心10min,取上清液。在同样的条件下用等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提后,上清用2倍体积的异戊醇沉淀,70%乙醇洗涤,干燥后溶于100μLTE中,-20°C贮存备用。 1.3引物设计根据这七种含Pilz结构域蛋白的基因序列,分别设计合成了七对特异性扩增引物,其中5'端引物含有BamH1酶切位点,3'端引物含有HindⅢ酶切位点(表1)。表1PCR引物序列注：F表示上
7、游引物，R表示下游引物1.4目的基因的扩增以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板,分别用各自的特异性引物扩增出它们完整的基因。PCR反应体系为50μL,其中含1XPCR缓冲液5μL,10mM的dNTPs1μL,10μM的5'端引物和3'端引物各1μL,2.5U·μL-1的Pfu聚合酶1μL,模板DNA100ng。PCR扩增条件为：94°C预变性2min;94°C变性30s,54°C退火30s,72°C延伸2min,共30个循环;最后72°C延伸5min。反应结束后,取5μLPCR扩增产物,1.0%琼脂糖凝胶
8、电泳检测。 1.5表达质粒的构建及表达将上述PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳回收。目的DNA片段及载体pET32a分别用BamH1和HindⅢ8双酶切,按8∶1的比例混合,用T4DNA连接酶16°C连接过夜。将构建的pET32a-Pilz载体,分别转化E.coliBl21(DE3)感受态细胞,37°C过夜培养,随机挑取单个菌落接种于5mLLB(含氨苄西林)培养液,37°C振荡培养细菌达A600=
