铜绿假单胞菌cmcc中青霉素结合蛋白-的克隆表达和纯化.

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1、由于抗生素可用于治疗各种感染性疾病，有的人就将抗生素作为万能药，不管得了什么病，都用抗生素治疗。要知道，滥用抗生素，可引起许多不良的后果。因此强调合理使用抗生素，重视抗生素的毒副作用是很有必要的。那么，该如何合理使用抗生素呢？（1）病毒性疾病不宜用抗生素治疗。上呼吸道感染以及咽痛、咽峡炎，大部分是病毒感染所致，因此这类疾病无需抗生素而应使用病毒灵、病毒脞等抗病毒药物以及中草药治疗。（2）应根据细菌培养和药敏试验结果选用抗生素。但如果受条件限制或病情危急，亦可根据感染部位和经验选用，然而可靠性较差。一般情况下，呼吸道感染以革兰氏阳性球菌为多见。尿道和胆道感染以革兰氏阴性

2、菌为多见。皮肤伤口感染以金黄色葡萄球菌为多见。（3）抗生素可以治病，同时也会产生副作用，没有一个抗生素是绝对安全而无副作用的。如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等可损害第八对脑神经而造成耳聋。青霉素可发生过敏性休克，还会引起皮疹和药物热。应用广谱抗生素如四环素等会使体内耐药细菌大量生长繁殖，而引起新的更严重的感染，因此使用抗生素应有的放矢，不可滥用。（4）新生儿、老年人和肝肾功能不全的人应避免或慎用主要经肝脏代谢和肾脏排泄的毒性较大的抗生素。（5）预防性应用抗生素要严加控制，尽量避免在皮肤、粘膜等局部使用抗生素，因其易导致过敏反应，也易引起耐药菌株的产生。铜绿假单胞菌CMC

3、C10104中青霉素结合蛋白-3的克隆表达和纯化引言：铜绿假单胞菌是一种能够感染植物、动物和人类的革兰氏阴性细菌，医院中的病人因他们的肺部、血液、尿液、皮肤、和软组织被铜绿假单胞菌感染而发病甚至死亡。铜绿假单胞菌也是一种重要的水生病原菌，广泛分布在各种各样的水体中，并且对消毒剂、干燥、紫外辐射等其他的物理化学因子具有很强的抗性，因此可以造成急性肠胃炎、脑膜炎、败血症和急性皮肤病。由于铜绿假单胞菌耐药性的出现，因此迫切需要去选择一些抗菌策略来控制它们的感染。细胞壁结构对于细菌的生存是非常的重要，青霉素结合蛋白（PBPs）是一些膜结合酶，它们主要参与到细菌细胞壁合成的后期

4、阶段。它们在70年前就已经被开发利用，被认为是B-内酰胺类抗生素的目标结合物。铜绿假单胞菌PAO1的基因组编码的四种高分子量的青霉素结合蛋白（PBPs）,包括一级A酶(PBP1a)和三级B酶(PBP2,PBP3,andPBP3a),它们与大肠杆菌中对应的酶是直系同源的。同时，铜绿假单胞菌的青霉素结合蛋白（PBP3）与大肠杆菌的对应蛋白具有42%序列一致性。铜绿假单胞菌的青霉素结合蛋白（PBP3）是有两个部分组成的蛋白，它包括：一个C-端的转肽酶结合到一个延伸的N-端领域。总的来说，PBP3与其他种类的青霉素结合蛋白是相似的，虽然它缺乏PBP2X结构所特有的C-端附属结

5、构，但是它和其他种类的PBPS一样，都具有a-螺旋亚基或头部结构朝向PBP3的N-端，这在PBP2结构中是没有的。种类B的青霉素结合蛋白的N-端区域的功能目前还不清楚，但是很有可能使转肽酶的结构远离细胞内膜。在铜绿假单胞菌中PBP3是一个药物作用靶点，并且已经证明了是大部分B-内酰胺类抗生素的重要的药物作用靶点，B-内酰胺类药物通常是用于治疗假单胞菌属的感染。包括头孢菌素类似物、头孢霉素、头孢他啶、哌拉西林、和注射用药物的抗生素、多利培南。然而，在最近几年，青霉素结合蛋白的改变使得铜绿假单胞菌对B-内酰胺类的抗生素具有耐药性。使用高剂量的哌拉西林来处理临床的分离菌，表

6、明了这与抗生素结合到PBPs上的减少有关。实验菌株缺乏B-内酰胺酶，在铜绿假单胞菌中PBP3的过量表达导致了它们对头孢霉素的敏感性降低。因此，进一步研究PBP3的基因和结构是很有必要很有意义。铜绿假单胞菌CMCC10104是一种典型的培养菌株，在中国广泛使用。然而，它的基因组和蛋白质组学的研究没有报道过。在本研究中，根据铜绿假单胞菌PAO1的基因组信息将编码PBP3的基因从铜绿假单胞菌CMCC10104中克隆出来，克隆出来的基因和GenBank数据库中报道过的其他PBP3基因序列进行对比，不同之处是实验的条件优化了蛋白的表达。带有Ni2+–NTA琼脂糖的固定化金属亲和

7、色谱层析(IMAC)法用于纯化重组蛋白PBP3，纯化的PBP3蛋白的活性通过青霉素结合实验来测定。材料和方法细菌、质粒、酶、试剂和培养基：菌株P.aeruginosaCMCC10104是从中国的菌种保藏中心获得，大肠杆菌DH5a用于载体的转化，E.coliBL21(DE3)用作蛋白表达的宿主菌，质粒pMD19-T和pET44b分别用于T-A克隆和蛋白质的表达。限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶和TaqDNA聚合酶都是购于Takara(Japan).分子生物试剂盒和IMAC等仪器试剂都是来源于BIO-RAD(USA).其他的分析试剂都是购于上海生工试剂