反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定论文

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1、反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定论文许朱定，宋振顺，安家泽，李韧，张福琴，窦科峰【关键词】,基因表达Constructionandidentificationofrebinanteukaryoticexpressionvectorofhumanantisensecorticalactinassociatedproteingene【Abstract】AIM:ToconstructarebinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.0/cortactincontainingfunctionalregionofhumanantisense

2、corticalactinassociatedproteingene(cortactin),soastoprovideatoolforthefurtherstudyontheimpactofcortactininhepatocellularcarcinoma(HCC)metastasis.METHODS:TotalRNAethodfromcelllineMHCC97.CDNAplifiedusingreversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR).ProductofPCR,amplifiedbybeingtransformedin

3、toE.coliDh5α,edthatcortactincDNAetastaticHCCcelllineMHCC97;reversetranscriptasepolymerasechainreaction;humancorticalactinassociatedprotein(cortactin)【摘要】目的：构建一个包含人皮层肌动蛋白（cortactin）反义基因的全部功能区的重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin，为进一步研究人皮层肌动蛋白对人肝癌细胞的转移影响的研究奠定基础.方法：Trizol试剂法提取体外培养的人肝癌高转移细胞株MHCC97总RNA，经逆转录聚

4、合酶链式反应（RTPCR）扩增目的片段.freelHI）、pMD18T载体、Trizol试剂为Takana公司产品；胶回收试剂盒为BioDev公司产品；质粒小量抽提试剂盒为Vgene公司.PCR引物：根据GeneBank中查到的cortactin的mRNA序列，用软件PrimerPremier5.0设计上下游引物，引物序列如下（划线部分分别是BamHI和XhoI的碱基识别序列，斜体部分为保护序列）：上游引物5′ATACTCGAGGTGGAACAAGACCGAATGGA3′；下游引物5′TAGGATCCATCCCAGCCAAGGGCACATT3′.1.2方法1.2.1高转移肝癌细胞M

5、HCC97培养将购回的细胞经2.5g/L胰蛋白酶消化传代，培养于含100mL/L胎牛血清的高糖型DMEM完全培养液中，置于37℃含50mL/LCO2的孵箱中培养，每3d换液1次，直至铺满.1.2.2总RNA的提取用2.5g/L胰蛋白酶消化培养铺满的肝癌细胞MHCC97，PBS洗涤后转移至1.5mL微量离心管中，离心1000g离心10min，弃上清，加入1mLTrizol试剂，立即反复抽吸至细胞充分裂解，静置5min，加入200μL氯仿剧烈振荡15s，低温离心机4℃12000g离心20min，取水相至一新的微量离心管中，加入等体积的异丙醇，4℃静置60min，低温离心机4℃12000

6、g离心20min，弃上清，750mL/L乙醇洗涤沉淀2次、4℃5000g离心10min，弃上清，沉淀自然干燥3min，加入15μL无Rnase水溶解沉淀.取5μL行凝胶电泳；2μL用于反转录.1.2.3反转录合成cDNA根据反转录试剂盒的说明用随机六聚体法反转录合成cDNA.将反应体系置于冰上，取总RNA2μL+引物(随机六聚体)1μL+去离子水9μL于PCR反应管中，轻轻混匀，在PCR反应仪中70℃静置5min；放置冰上，依次加5×Buffer4μL,Rnase抑制剂1μL和dNTP2μL，轻混匀，25℃5min；立即冰浴后加入反转录酶1μL（终体积20μL），轻混匀后依次进行2

7、5℃10min,42℃60min,70℃10min和立即冰浴.取cDNA进行PCR.1.2.4PCR扩增目的片段cortactin基因在PCR反应管中建立50μL反应体系：Buffer5μL,MgCl23μL,Sense2.5μL,.freelin后加Taq酶0.5μL.反应条件为：94℃预变性4min后，95℃变性30s，56℃退火2min，72℃延伸2min，共35个循环，72℃再延伸7min.最后4℃保存.产物行凝胶电泳.目的片段切胶按胶回收试剂盒说明行胶回收纯