kiss 1基因重组真核质粒的构建、鉴定及其表达

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1、KiSS1基因重组真核质粒的构建、鉴定及其表达：徐玫芳臧盛兵黄爱民刘景丰高凌云高美钦【摘要】　　目的构建KiSS1基因重组真核质粒，将其导入人高转移肝癌MHCC97H细胞中，获得瞬时表达的细胞株，为进一步研究KiSS1基因对人肝癌细胞侵袭转移的影响奠定基础。方法Trizol试剂法提取新鲜胎盘组织总RNA，经RTPCR扩增目的片段，PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接，并转化入大肠杆菌Ecoli.Dh5α扩增以获得重组载体，采用脂质体介导转染技术将高纯度的KiSS1质粒转染到人高转移肝癌细胞株中，用RTPCR和H

2、CC97H细胞中。结论成功获得pcDNA3.1/HisC/KiSS1重组质粒和瞬时表达KiSS1基因的肝癌细胞，为后续建立稳定转染的KiSS1高表达阳性细胞克隆奠定基础，为体内外实验研究KiSS1对人肝癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前提条件。【关键词】肿瘤抑制蛋白类遗传载体转染肝肿瘤肿瘤侵润真核细胞核质粒　　肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，居男性恶性肿瘤第3位，病死率高，为恶性肿瘤的第二死因[1]。HCC易发生早期侵袭转移，是患者术后高复发乃至死亡的主要原

3、因。KiSS1作为一个肿瘤转移抑制基因，在很多肿瘤的侵袭转移过程中起重要作用[23]，但在与肝癌关系的研究中，国内外部分学者发现其与肿瘤转移抑制作用存在相悖[45]。因此深入研究KiSS1基因的表达与HCC侵袭、转移及预后的关系很有必要。为此，笔者利用基因克隆技术构建了真核表达载体pcDNA3.1/HisC/KiSS1，并将其导入人高转移HCCMHCC97H细胞中，获得瞬时表达的细胞株，为后续建立稳定转染的KiSS1高表达阳性细胞克隆奠定基础,为体内外实验研究KiSS1对人HCC细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前

4、提条件。　　1材料与方法　　1.1材料新鲜胎盘组织于福建医科大学附属第一医院妇产科正常分娩的胎盘;大肠杆菌Ecoli.Dh5α、真核表达载体pcDNA3.1/HisC由福建医科大学分子医学生物中心惠赠;Trizol试剂及脂质体Lipofectamine2000为美国Invitrogen公司产品;RTPCR逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶(XhoI,BamHI)、T4DNA连接酶为美国Fermentas公司产品;质粒大量抽提试剂盒为北京Tiangen公司产品;兔抗人KiSS1为美国Santacruz公司产品;Eli

5、visionplus二抗试剂盒为福州迈新生物技术开发公司产品;细胞裂解液为美国Pierce公司产品;PCR引物：根据GeneBank中查到的KiSS1的mRNA序列，用软件PrimerPremier5.0设计上下游引物，由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下(划线部分分别是BamHI和XhoI的碱基识别序列，斜体部分为保护序列)：　　上游：5′CCAGGATCCATGAACTCACTGGTTTCTTGG3′　　下游：5′AGACTCGAGTCACTGCCCCGCACCTG3′　　1.2方法　　1.2.1重组真核质粒的构

6、建与鉴定　　1.2.1.1RTPCR扩增目的片段KiSS1基因取50mg冷冻的新鲜胎盘组织Trizol试剂法提取总RNA，经紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性;所得RNA用Fermentas逆转录试剂盒将其逆转为cDNA，并将其通过PCR法进行扩增，产物行凝胶电泳，目的片段按胶回收试剂盒说明书行胶回收纯化，-20℃保存。　　1.2.1.2KiSS1和真核表达载体pcDNA3.1/HisC的酶切与连接0.2mL离心管中依次加入BamHI1μL、XhoI2μL、BufferBamHI2μL及Ki

7、SS1DNA15μL，37℃水浴过夜，加入6×上样缓冲夜4μL进行琼脂糖凝胶电泳，将酶切的产物胶回收。BamHI、XhoI双酶切质粒pcDNA3.1/HisC，步骤同上。将上述回收产物加入如下反应体系：10×连接缓冲液2μL，T4DNA连接酶1μL，双酶切KiSS19μL，双酶切pcDNA3.1/HisC8μL，终体积20μL，4℃连接过夜。取上述连接产物10μL转化至150μL感受态大肠杆菌Ecoli.Dh5α中，在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃培养16～20h，形成单菌落。随机挑选2～3个菌落分别接种于LB液体培养基

8、2mL中(含氨苄青霉素2μL)，37℃摇床250r/min振荡过夜。　　1.2.1.3阳性重组子的鉴定(1)PCR鉴定重组质粒。取1μL上述振摇扩增过夜的菌液，PCR法进行扩增，产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。(2)双酶切鉴定重组质粒。将PCR鉴