携带hTERT-P2A-EGFP基因的真核表达质粒的构建及鉴定.docx

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1、携带hTERT-P2A-EGFP基因的真核表达质粒的构建及鉴定目的构建真核表达质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP,探讨重组质粒在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。为进一步研究hTERT基因的功能及构建永生化细胞系奠定基础。方法真核质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP的构建:(1)以pBABE-puro-hTERT和pRRL-EGFP质粒为模板利用PCR技术分别扩增目的基因hTERT、P2A和EGFP,对PCR产物进行胶回收纯化。(2)以凝胶回收的3个目的片段为模板,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P

2、2A-EGFP。(3)载体pRRL-与目的片段hTERT-P2A-EGFP酶切处理后进行重组反应。(4)重组质粒的序列测定和定点突变,设计含有突变位点正确碱基的引物,利用FastDigestDpnⅠ,进行定点突变。真核质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP的鉴定:(1)复苏冻存的HEK293FT细胞,并进行传代培养。(2)经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达。(3)利用流式细胞仪检测重组质粒在HEK293FT细胞中的转染效率。(4)四质粒系统包装病毒,利用lipo2000

3、将已合成的所需质粒转染到293FT细胞系中,收集病毒进行浓缩、滴定、流式检测,从而获悉病毒滴度及感染力。(5)重组病毒感染人胚胎肝脏细胞后,提取细胞RNA,RT-PCR法检测细胞hTERT基因的表达水平。结果1.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段分别为3500、110和720bp,与预期结果一致。2.目的基因片段hTERT-P2A-EGFP的电泳结果约4300bp,与预期片段大小一致。3.测序结果显示,目的基因1547位点发生了突变。利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与G

4、enBank公布的基因序列完全一致。4.重组质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP酶切鉴定,电泳产生约4300bp目的条带,质粒构建成功。5.重组质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP转染HEK293FT细胞24h后,在荧光显微镜下可以观察到细胞中有绿色荧光产生。6.流式细胞检测结果显示重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%。7.浓缩后的hTERT病毒液10μL感染细胞,流式细胞检测293FT细胞GFP的阳性率为32.7%,经计算重组慢病毒的滴度为1.6×107。8.hTERT慢病毒感染人胚胎肝脏细胞后,R

5、T-PCR检测实验组的hTERT基因的表达较对照组有明显升高。结论1.目的基因hTERT-P2A-EGFP的序列与GenBank公布的基因序列一致。2.经酶切鉴定后,重组质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP构建成功。3.重组质粒转染HEK293FT细胞后,可在细胞内表达。4.慢病毒感染细胞后,hTERT基因的表达量升高。4.3.3.