结核分枝杆菌rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

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1、结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达【关键词】分枝杆菌,结核;Rv2389;基因表达  ConstructionandexpressionofeukaryoticexpressionvectorofMycobacteriumtuberculosisRv2389  【Abstract】AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorencodingMycobacteriumtuberculosisRv2389andexpressitinCHOcells.METHODS:Thegeneenco

2、dingRv2389protEinplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)fromgenomeofMycobacteriumtuberculosisH37Rvstrain.Aftersequenced,Rv2389genesegmentsidpCDNARv2389e.TheexpressionsofmRNAandprotEInencodedbythisgenemunofluoresenttechnology.RESULTS:Rv2389RNAandproteinlevelsidencodingRv2389ent

3、establishedthebasisforfurtherstudyonthefunctionofRv2389.  【Keyycobacteriumtuberculosis;Rv2389;geneexpression  【摘要】目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后,分别以RTPCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNARv2389,RTPCR结

4、果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNARv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.  【关键词】分枝杆菌,结核;Rv2389;基因表达  0引言    结核病是目前危害全球人类健康的重要传染病.这主要是因为①卡介苗(BCG)对成年人结核病的预防效果不稳定,保护力为0%~70%;②没有特异性的诊断试剂;③艾滋病等免疫缺陷个体的出现加快了本病的严重后果;④耐药菌株的大量出现[1].因而寻找更有效的替代卡介苗的疫苗已

5、成为当务之急.Rv2389蛋白是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)复活促进因子(resuscitationpromotingfactor,Rpf)样蛋白家族的一员,序列分析发现,它不仅与细菌的增殖有关,还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原[2].为此,我们在Rv2389原核表达和纯化的基础上,构建了真核表达载体并在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中进行表达,同时从其表达水平和基因转录两方面进行鉴定,为其功能研究奠定基础.  1材料和方法  1.1材料MTBH37Rv菌株,P815细胞由本室保存;真核表达载体p

6、CDNA3.1(-)由本室保存;含有Rv2389基因的重组质粒pProEXHTRv2389由本室构建保存;Rv2389蛋白多抗由本实验室制备;AMV,RNA酶抑制剂和TRIzol(Promega公司);限制性内切酶、T4DNA连接酶和核酸分子质量标准品(宝泰克公司);质粒提取试剂盒(Omega公司);梭华soft阳离子聚合物(厦门太阳马公司);羊抗鼠荧光抗体(宝信公司).  1.2方法  1.2.1Rv2389基因片段的扩增与测序结核分枝杆菌Rv2389全基因序列的特异性引物序列为:P1:5′ggatccgccaccatgaccccgggttt

7、gcttac3′,含BamHⅠ酶切位点,起始码和cozak序列;P2:5′ccgaagcttatcgtccctgctccccgatga3′,含HindⅢ酶切位点和终止码.PCR反应条件:94℃40s,56℃30s,72℃1min,共30个循环,72℃延伸10min.回收PCR产物,用T4连接酶将PCR产物与pGEMTeasy载体连接,转化E.coliDH5α,随机挑取5个克隆提取质粒进行双酶切鉴定,取2个鉴定正确的克隆进行测序[3].  1.2.2重组质粒的构建及鉴定将测序正确的Rv2389基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1(-),构建重组

8、质粒pCDNARv2389.连接转化、质粒提取均按  2结果  2.1目的基因的扩增、克隆及酶切鉴定用PCR方法从H37Rv中扩增出Rv2389的DN

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