结核分枝杆菌rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

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1、结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达【关键词】分枝杆菌,结核；Rv2389；基因表达　　ConstructionandexpressionofeukaryoticexpressionvectorofMycobacteriumtuberculosisRv2389　　【Abstract】AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorencodingMycobacteriumtuberculosisRv2389andexpressitinCHOcells.METHODS:Thegeneenco

2、dingRv2389protEinplifiedbypolymerasechainreaction（PCR）fromgenomeofMycobacteriumtuberculosisH37Rvstrain.Aftersequenced,Rv2389genesegmentsidpCDNARv2389e.TheexpressionsofmRNAandprotEInencodedbythisgenemunofluoresenttechnology.RESULTS:Rv2389RNAandproteinlevelsidencodingRv2389ent

3、establishedthebasisforfurtherstudyonthefunctionofRv2389.　　【Keyycobacteriumtuberculosis;Rv2389;geneexpression　　【摘要】目的：构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法：PCR扩增Rv2389基因，测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)，重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后,分别以RTPCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果：构建了重组质粒pCDNARv2389，RTPCR结

4、果证明Rv2389可在CHO细胞中转录，间接免疫荧光检测证明，表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论：成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNARv2389，Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.　　【关键词】分枝杆菌，结核；Rv2389；基因表达　　0引言　　　　结核病是目前危害全球人类健康的重要传染病.这主要是因为①卡介苗（BCG）对成年人结核病的预防效果不稳定，保护力为0%~70%；②没有特异性的诊断试剂；③艾滋病等免疫缺陷个体的出现加快了本病的严重后果；④耐药菌株的大量出现［1］.因而寻找更有效的替代卡介苗的疫苗已

5、成为当务之急.Rv2389蛋白是结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB)复活促进因子（resuscitationpromotingfactor,Rpf）样蛋白家族的一员，序列分析发现，它不仅与细菌的增殖有关，还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原［2］.为此，我们在Rv2389原核表达和纯化的基础上，构建了真核表达载体并在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中进行表达，同时从其表达水平和基因转录两方面进行鉴定，为其功能研究奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料MTBH37Rv菌株,P815细胞由本室保存；真核表达载体p

6、CDNA3.1(-)由本室保存；含有Rv2389基因的重组质粒pProEXHTRv2389由本室构建保存；Rv2389蛋白多抗由本实验室制备；AMV，RNA酶抑制剂和TRIzol（Promega公司）；限制性内切酶、T4DNA连接酶和核酸分子质量标准品（宝泰克公司）；质粒提取试剂盒（Omega公司）；梭华soft阳离子聚合物（厦门太阳马公司）；羊抗鼠荧光抗体（宝信公司）.　　1.2方法　　1.2.1Rv2389基因片段的扩增与测序结核分枝杆菌Rv2389全基因序列的特异性引物序列为：P1：5′ggatccgccaccatgaccccgggttt

7、gcttac3′，含BamHⅠ酶切位点，起始码和cozak序列；P2：5′ccgaagcttatcgtccctgctccccgatga3′，含HindⅢ酶切位点和终止码.PCR反应条件：94℃40s，56℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min.回收PCR产物，用T4连接酶将PCR产物与pGEMTeasy载体连接，转化E.coliDH5α，随机挑取5个克隆提取质粒进行双酶切鉴定，取2个鉴定正确的克隆进行测序［3］.　　1.2.2重组质粒的构建及鉴定将测序正确的Rv2389基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1(-)，构建重组

8、质粒pCDNARv2389.连接转化、质粒提取均按　　2结果　　2.1目的基因的扩增、克隆及酶切鉴定用PCR方法从H37Rv中扩增出Rv2389的DN