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《人gm-csf基因原核表达质粒的构建与表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、人GM-CSF基因原核表达质粒的构建与表达景巧1邵辉2杨晓玲3(通讯作者)(1宁夏国龙医院妇产科宁夏银川750004)(2宁夏医科大学总医院耳鼻喉科宁夏银川750004)(3宁夏医科大学病理生理学系宁夏银川750004)【摘要】目的克隆编码人粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组原核表达质粒，为进一步研宄其功能提供依据。方法PCR扩增人GM-CSF基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体PET32a+获得重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达,PCR和Western-blot鉴定表达产物。结果重组质粒经PCR、限制性内切酶及DNA测序证实构建成功;且诱导后能
2、在大肠杆菌中稳定表达PET-GMCSF嵌合蛋白。结论成功构建并表达了PET-GMCSF蛋白，为进一步研究GM-CSF功能奠定基础。【关键词】GM-CSF原核表达构建【中图分类号】R318【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2014)06-0158-02粒-巨噬细胞集落刺激因了(Granulocytemacrophagecolony-stimulatingfactorGM-CSF)在造血调控和免疫调节中发挥重要作用［1,2］。克隆和纯化人GM-CSF对进一步研究GM-CSF在各个系统的功能兵有重要的意义。木实验利用基因工程技术，构建重组hGM-CSF原核表达载体，并诱导其
3、在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，获得融合蛋白PET-GMCSF,为今后深入研究该蛋白的功能打下基础。1.材料1.1菌株及质粒大肠杆菌E.coliDE3购自天根生物,pORF-hGMCSF质粒购自Invitrogen公司，原核表达质粒PET32a+为木室保存。1.2主要试剂primeSTARTMHSDNA聚合酶、dNTP、DNA连接试剂盒是Takara公同产品;EcoRI、Hindlll及蛋白分了•量标准购自晶美公司;Omega质粒提取试剂盒、PCR产物冋收试剂盒及胶冋收试剂盒购自宝信生物;抗His-单克隆抗体购自天根生物;DAB底物显色试剂盒为北京中杉公司产品;其余均为分析纯。
4、1.方法2.1人GM-CSF基因的PCR扩增根据Genbank中报告的人GM-CSF的CDS（登录号:M13207.1）设计引物:Pl:5’-CGGAATTCATGTGGCTGCAGAGCCTG-3’,P2:5’-CCAAGCTTTCACTCCTGGACTGGCTC-3’/划线部分是EcoRI和Hindlll酶切位点。以pORF-hGMCSF质粒为模板，以Pl和P2为引物,95°C预变性5分钟,94°C变性30秒,60°C复性45秒,72°C延伸1分钟,30个循环,72°C延伸10分钟，扩增hGM-CSF基因。取PCR产物进行1.5%
5、琼脂糖凝胶电泳,PCR产物冋收试剂盒冋收0的基因GM-CSF。2.2重组表达质粒PET-GMCSF构建与鉴定按照Omega质粒提取说明书提取和纯化PET32a+质粒，将PET32a+和GM-CSF基因分别用EcoRI和Hindlll双酶切后,16°C连接4h,转化宿主菌E.coliDE3。随机挑取氨卞青霉素霉素抗性的阳性重组子接种于5mLLB液体培养基中,37°C振摇过夜，提取质粒行PCR鉴定，另一方面用EcoRI和Hindlll双酶切消化,电泳检测有无插入片段及苏大小，并将与预期大小相符的重组质粒送Invitrogen公司进行DNA序列分析。2.3重组蛋白的诱导表达挑取单克隆在加
6、冇氨卞青霉素霉素的液体LB培养基中37°C220r/min振摇培养10h,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导5-6h,分离培养液上清和沉淀，将菌体沉淀重悬于PBS缓冲液中（PH7.2）,超声裂解并离心分离上清和沉淀,SDS-PAGE电泳后转膜,加入抗His-单克隆抗体室温2h,再•加入HRP标记的羊抗鼠IgG进行Western-Blot分析。2.结果3.1GM-CSF基因的扩增用PCR法从pORF-hGMCSF质粒获得435bp的人GM-CSF基因片段，与预期的GMCSF基因大小一致（见图1）。图1GM-CSF基因的扩增3.2重组质粒的鉴定以抗生素筛选阳性重组子提取质粒为
7、模板行PCR扩增,并用EcoRI、Hindlll双酶切后均证实有大小为435bp的目的片段插入PET32a+质粒，测序结果和GenBank中人GM-CSF基因完全匹配(100%)，表明重组质粒构建成功(见图2)。图3融合蛋白PETGM-CSF的表达1:空质粒;2:重组质粒1.讨论人GM-CSF基因编码144个氨基酸(约16.3kDa)，其中信号肽为17个氨基酸构成，是一•种能够刺激粒细胞、巨噬细胞形成集落的细胞因子，能在体外调控粒细胞、单核/巨噬细胞的分化、增殖和存活
