人源gm-csf、il-4基因串联共表达重组克隆质粒构建与表达

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1、万方数据目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3符号说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·1／日IJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。第一部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、35讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38第二部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·39材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-62乌宗

3、述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一·66万方数据致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一73攻读学位期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．74原创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。75万方数据泰山医学院硕士学位论文人源GM-CSF、IL一4基因串联共表达重组克隆质粒构建与表达研究生：殷殷专业：病原生物学导师：于爱莲教授王玉副教授中文摘要目的本课题以人白细胞介素一4(白介素一4，Interleukin-4，IL一4)，粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(granuloc

4、yte—macrophagecolonystimulatingfactor，GM—CSF)为模型细胞因子，建立并优化人源性细胞因子的组合，并在真核细胞中稳定性表达重组蛋白及其活性研究，这为多细胞因子在体外能够共同表达提供了实验素材和理论参考。构建人GM—CSF、IL一4基因各自独立和经IRES元件串联的重组真核表达质粒pGM—CSF、plL一4和pGM—CSF—IRES—IL-4，转染细胞并经过连接免疫荧光(indirectimmunofluorescenceassay，IFA)及酶联免疫吸附测定(enzyme．1inkedimmunosorbentassay，Elisa)检测其

5、表达活性，为构建永久表达细胞系做准各，同时人源细胞因子的体外表达及其诱生DC／CIK培养试剂盒的研发奠定了基础。方法1．引物和质粒的设计与合成依据GenBank上已经公布了的人源性GM-CSF、IL．4基因的参考序列。分别设计了附加酶切位点的引物，酶切位点为XhoI、BglII和SalI、MluI，以及质粒pMDl5一T—CSF、pMDl5一T—IL一4。2．重组质粒pGM—CSF、plL-4、pGM—CSF．IRES—IL一4的构建经PCR扩增重组质粒pMDl5一T-CSF、pMDl5一T．IL．4中的目的片段GM—CSF、IL-4；利用0．8％琼脂糖凝胶电泳进行回收、琼脂糖凝

6、胶回收纯化好的的PCR产物，分别在各自的酶切位点处进行双酶切，目的是回收两条目的基因片段GM—CSF和IL一4；用T4连接酶分别与经同步酶切的载体片段lasT—ASG上进行连接，经在固体培养皿上长出的优势抗性菌落的常规筛选，构建单独表达GM．CSF、IL一4基因的重组质粒pGM—CSF、plL一4：将目的基因与连接片段IRES分步连接到PsT．ASG载体】万方数据泰山医学院硕士学位论文上，经在固体培养皿上长出的优势抗性菌落的常规筛选，构建pGM—CSF—IRES—IL一4真核表达载体。3．重组质粒pGM—CSF、plL一4、pGM—CSF—IRES—IL一4在CHO细胞中的瞬时表

7、达将重组质粒pGM—CSF、plL一4、pGM—CSF—IRES-IL一4在阳性脂质体的介导下转染CHO细胞，24小时后检测GM—CSF、IL一4在CHO细胞中的表达。4．1FA及Elisa检测表达情况对转染的CHO细胞用IFA和Elisa检测人源GM—CSF、IL-4基因的蛋白质表达。结果1．真核表达质粒pGM—CSF、pIL一4、pGM．CSF．IRES—IL-4的构建成功构建的三种真核表达质粒pGM—CSF、plL一4和pGM—CSF—IRES—IL-4，分别在经菌落PCR