小鼠il-33基因cdna克隆与真核质粒的构建与表达

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1、小鼠IL-33基因cDNA克隆与真核质粒的构建与表达作者：张林，程晓刚，练栩辉，李鑫，刘林娜，赵柏程，任飞，李晗郡，刘平【摘要】　　目的克隆小鼠IL-33基因(mIL-33)cDNA构建其真核表达质粒，并转染EL-4细胞检测其表达。方法提取小鼠脑与肺组织总RNA，经逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因cDNA，酶切后插入pcDNA-3.1构建其真核表达载体pcDNA-mIL-33，重组质粒转染EL-4细胞，RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。结果pcDNA-mIL-33中插入的DNA序列测定结

2、果与mIL-33cDNA序列一致，重组质粒转染EL-4细胞后检测到相应基因表达。结论成功克隆小鼠IL-33基因cDNA，并构建其真核表达质粒。【关键词】IL-33；基因克隆；真核表达　　Abstract:ObjectiveTocloneandconstructtheeukaryoticexpressionplasmidscontainingmouseIL-33cDNAandinvestigatetheirexpression.MethodsTotalRNAwasextractedfrommouselungandbraint

3、issuestoamplifymouseinterleukin-33(mIL-33)cDNAbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR).The9eukaryoticexpressionplasmidspcDNA-mIL-33wasconstructedwiththeinsertionofenzyme-digestedpcDNA-3.1(+)vectortoconstructeukaryoticexpressionvectorpcDNA-mIL-33.Ther

4、ecombinantplasmidsweretransfectedintoEL-4cellsandtheexpressionoftargetgenewasdetectedbyRT-PCRandELISA.ResultsTheinsertedDNAsequenceinpcDNA-mIL-33wasidenticaltothemIL-33cDNA,whichwasverifiedcorrectlybysequencing.Thecorrespondinggeneexpressionwasdetectedintherecombi

5、nantplasmid-transfectedEL-4cells.ConclusionThemouseIL-33cDNAwassuccessfullyclonedanditseukaryoticexpressionplasmidswereconstructed.　　Keywords:IL-33;genecloning;eukaryoticexpression　　白细胞介素33（IL-33）是近几年发现的细胞因子,为IL-1类细胞因子超家族成员［1］，已发现其在小鼠及人各组织内皮与上皮细胞中均有广泛表达。其相应受体为由IL-

6、1受体1（interleukin-1receptor-like1，IL1RL1）和IL-1受体辅助蛋白（IL-1Raccessory9protein，IL-1RAcP）2个亚基组成的异源二聚体，其中IL1RL1又称蛋白ST2［2］，上述两亚基均为IL-1受体超家族成员。研究表明IL-33和其配体结合后可促进肥大细胞与Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子并促进炎症反应［3-4］，在过敏性哮喘、过敏性休克、肺纤维化、风湿性关节炎等自身免疫性疾病及脓毒血症、败血性休克、某些恶性肿瘤与心肌炎等发生发展中起重要作用

7、［5-6］。本研究旨在克隆小鼠IL-33基因的cDNA，构建其真核表达质粒pcDNA-mIL-33并实现在EL-4细胞中表达，为研究IL-33蛋白的生物学功能并为实现其原核表达奠定基础。　　1材料和方法　　1.1动物、质粒和菌株　　BALB/c小鼠来自本校科研中心动物室，真核表达质粒pcDNA3.1(+)（5.4kb)、大肠杆菌E.coliDH5α菌株、小鼠淋巴瘤细胞株EL-4为本校免疫学教研室保存。　　1.2主要试剂和器材　　载体连接试剂盒、限制性核酸内切酶、DNA凝胶回收试剂盒、PCR试剂购自TaKaRa公司，T4DN

8、A连接酶为Promega公司产品，质粒抽提试剂盒购自Omega公司，Trizol为Invitrogen公司产品，RevertAidTMcDNA第一链合成试剂盒为Fermentas公司产品，KeyGenTransⅢ质粒转染试剂、细胞裂解液及蛋白酶抑制剂购自凯基生物发展有限公司，MouseIL-33Quan