微小牛蜱Bm86基因的克隆、真核表达及cDNA文库的构建

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1、甘肃农业大学2。。5届硕士毕业论文Y724288微小牛蜱Bm86基因的克隆、真核表达及eDNA文库的构建摘要以微小牛蜱饥饿幼蜱为材料，提取总RNA，采用RT—PCR技术扩增了微小牛蜱Bm86基因，并将其与真核表达载体pPIC9K进行重组：电转化毕赤酵母后，用0．5％甲醇进行诱导表达，通过SDS—PAGE和Westernblot方法对培养上清中的表达产物进行分析。结果表明：本试验自从微小牛蜱中成功克隆了Bm86基因，它与I!lGenBank上下载的国外发表的Bin86基因的同源性达97．4％，并构建了真核表达载体pPIC9K—Bm86，转化后经P

2、CR％正实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中。通过甲醇诱导，重组菌株高效地分泌表达TBm86蛋白，表达浓度为0．36mg／mL，占分泌总蛋白质的32％。经初步纯化，对表达产物的性质鉴定表明，其分子量约ff968KD，具有免疫活性。该研究为大量获得重组Bm86蛋白，研制微小牛蜱分子疫苗奠定基础。为了自微小牛蜱获得新的免疫相关基因，构建了微小牛蜱eDNA文库。从微小牛蜱幼蜱研磨物中提取总RNA，并分离纯化mRNA，采用oligo(dT)引物合成双链eDNA，接着在其两端加＆甜I／研删IⅡ定向接头；然后将所产生的eDNA分子用MiniColumnFra

3、ctionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到九SCREEN载体的EcoRI和HindIII的双酶切位点之间，体外包装后得到我国微小牛蜱幼虫eDNA文库。经测定，所构建的表达文库的容量为4．5X105pfu／ml，扩增后的文库库容量为7．2X1010pfu／ml，重组率为97％．这说明所构建微小牛蜱幼虫eDNA表达文库库容量大、重组率高，为进一步分离其功能性抗原基因奠定基础。关键词：微小牛蜱；Bm86基因；表达：毕赤酵母；eDNA表达文库；构建甘肃农业大学2005届硕士毕业论文CloningandEukaryoticExpressionofBm

4、86andConstructionofeDNALibraryofBoophilusmicroplusAbstractInordertocloneandexpressionBm86ofBoophUusmicroplusin肭／apastorissystem．Bin86genewasclonedfromthelarvaeofB．microplusbv脏二PCI乙TheresultsshowthatthenucleotidesequenceoftheBm86genesequencedshares97．4％homologywiththatpublish

5、edinGenBankdataandthisfragmentcontainedthecompleteopenreadingframe(ORF)oftheBm86gene．TheinterestedBm86genewasinsertedintothesecretoryexpressionveetorpPIC9K，andpPIC9K-Bm86wasconstructedsuccessfullv．TherecombinantwaslinearizedwithSacIandelectroporatedintotheyeastcellGSll5．Itwa

6、sconfirmedthatinterestedBm86genewasintergretedwithinthegenomeoftheP．pastorisbyPCIt,andthemulticopyrecombinantwasnamedGSll5／pPIC9K．Bm86His+Mut十．Atierbeinginduceby0．5％methanoifor96hinshakingflasktoexpressBm86andtooktimepoints．theexpressedBm86proteinwasanalyzedbvSDS．PAGEandⅥ，es

7、ternblot．Theresul妇showthatBm86proteinexpressedsuccessfullyat恤e48“hourinP．pasto施．TheconcentrationofexpressedBm86proteinwas0．36mg／mLanditsmolecularweightisapproximately68KD．TheBm86expressedlevelcouldreachupto32％OftOtalproteinsinculturesupernatantandcouldbespeeificallyrecognize

8、dbythepostiveserumofrabbitwhichinfectedbyB．microplus．Atthesametime，inordert