乙型肝炎病毒x基因cdna的克隆及真核表达载体的构建论文

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1、乙型肝炎病毒X基因cDNA的克隆及真核表达载体的构建论文.freelanHBx-cDNAandconstructtheeukaryoticexpressionvectorofHBxcDNAforexploringthecontributionofHBXgenetothegenesisofhepatocellularcarcinoma.MethodsThetotalRNAextractedfromHepG2.2.15cellsedinsequence.freelidentedbyelectrophoresisafterdoub

2、ledigestione，ORF），分别称为S、C、P和X区。其中X区基因（HBx）是HBVDNA中最小的一个片断，编码基因位于1374-1838碱基位，全长465个bp，是HBV基因组内功能重叠最明显的区域，其转录受本身的启动子调控，是HBV转录和复制所必需的基因，在肝细胞癌的发生和发展中具有重要的作用。HBx蛋白为HBx基因编码的产物，间接调节转录，影响细胞生长、信号转导和DNA修复及凋亡等多种活性，可影响HCC形成的多个环节。为了进一步研究HBx及其产物在肝细胞癌发生中的作用，本实验构建了HBx基因的真核表达载体。1材

3、料和方法1.1实验材料1.1.1实验细胞HepG2.2.15细胞，由本室保存。1.1.2质粒PCDNA3.1质粒及宿主菌E.coliDH5α，由本室保存。1.1.3酶及主要试剂限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、T4DNA连接酶、RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒购自Promega公司，其他试剂为国产分析纯。1.2引物的设计与合成根据GenBank公布的HBxcDNA序列设计引物，上游引物为5′-TGTG-GAATTCATGGCTGCTAGGGTG-3′，下游引物为5′-TGTGAAGCTTCTAGGCAGAGGTGAA-

4、3′，引物由上海Invitrogen公司合成。1.3实验方法1.3.1总RNA提取HepG2.2.15细胞中RNA提取按试剂盒说明书进行。1.3.2RT-PCR合成HBx-cDNA以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR循环，条件为:94℃变性30s，55℃退火1min，68℃延伸2min，共进行35个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳分析。1.3.3HBx-PCDNA3.1重组体构建用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切HBx基因的RT-PCR产物和质粒PCDNA3.1，利用琼脂糖凝胶回收目的基因和载体片段，用T4DNA连接酶

5、将目的基因片段克隆至质粒PCDNA3.1的EcoRⅠ和HindⅢ位点之间，重组体转化大肠杆菌DH5α，筛选Amp抗性克隆，命名为HBx-PCDNA3.1。用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切重组质粒，琼脂糖电泳鉴定。1.3.4HBx-cDNA的序列测定ABI3700全自动测序仪测序。2结果2.1RT-PCR产物的电泳鉴定吸取7μlRT-PCR产物与2μl上样缓冲液混匀后，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，结果见图1，可见一约460bp的DNA条带。图1RT-PCR产物电泳图（略）1:1kbDNA标准样品2:RT-PCR产物2.2HBx-P

6、CDNA3.1电泳鉴定小量制备所获的质粒经双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示2条DNA条带，结果见图2。一条约为5.4kb，与pcDNA3.1载体碱基数相符;另一条DNA片段约460bp，与HBx碱基数相符。双酶切鉴定的结果证明得到了HBx-PCDNA3.1重组体（图2）。将重组子HBx-PCDNA3.1进行序列分析，并与文献报道的序列相比较，二者完全一致，表明重组子中已含有HBx的cDNA片段。图2含HBx-PCDNA3.1克隆的电泳鉴定（略）1:PCDNA3.1双酶切产物2:1kbDNA标准样品3:HBx-PCDNA3.1双酶

7、切产物3讨论本研究的目的在于克隆HBx的cDNA及构建HBxcDNA真核表达载体，为研究HBx与HCC发生和发展的关系提供可靠的基因来源。因此根据基因库中HBxcDNA序列设计了上下游引物，进行RT-PCR，并成功构建了真核表达载体HBx-PCDNA3.1。HBx基因是HBV复制必需的基因，其产物HBx蛋白是一种反式激活蛋白，HBx蛋白能诱导几种依赖磷酸化的信号转导途径而引起一系列反应，包括ras-raf-MAPK转导途径［1-2］、DAG-PKC转导途径、Jakl-STAT转导途径等，干扰细胞的转录和复制。HBx可通过多种

8、途径导致肝细胞和肿瘤细胞的凋亡异常，HBx蛋白可激活肝细胞FasL基因的表达以及HBx导致线粒体功能障碍，从而上调凋亡［3］;HBx通过上调SAPK.JNK活性，从而抑制Fas介导的肝癌细胞凋亡［4］。HBx通过与抑癌基因p53的相互作用，抑制p53的活性，干扰DNA的修复［5］。本实验成