人类tslc1基因克隆及真核表达载体的构建论文

《人类tslc1基因克隆及真核表达载体的构建论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建论文李文涛周闯赵永福马秀现张水军【摘要】目的：克隆人类TSLC1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1(+)/TSLC1.方法：从正常皮肤组织中提取总RNA，采用RTPCR方法扩增TSLC1基因全长cDNA，克隆入pMD18T载体并转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆，进行核苷酸测序分析，再将TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1(+)载体中构建表达载体.结果：RTPCR扩增后的产物在约1413bp处出现明显的特异性条带，TSLC1基因的cDNA片段被

2、成功插入真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒的多克隆位点，经鉴定与GenBank收录的TSLC1cDNA序列一致.结论：TSLC1基因的cDNA片段被成功克隆.freelorsuppressorinlungcancer1,TSLC1)，翻译产物是442个氨基酸的跨膜蛋白，该蛋白属于免疫球蛋白超家族成员之一［1］.TSLC1基因在肺癌、鼻咽癌、前列腺癌和宫颈癌均有不同程度的低表达异常，TSLC1不仅在诱导细胞周期的停滞及细胞凋亡中起重要作用，还在调节细胞黏连、迁移等生理功能中发挥重要作用［2］.TSLC1从发现至今时间尚短

3、，所以目前国内外对TSLC1基因及其表达产物的研究报道不多，国内尚未克隆出TSLC1基因.本研究我们克隆出了人TSLC1基因的cDNA片段,其中包含有全长的蛋白编码区,并将其插入真核表达载体，为后续将进行TSLC1对肿瘤相关功能的研究奠定基础.1材料和方法1.1材料皮肤组织来源于本院行包皮环切术的患者.质粒pcDNA3.1(+)（美国Invitrogen公司）；E.coliJM109菌株为本实验室保存.RPMI1640培养基、胎牛血清（Gibco公司）；TRIzol试剂（Invitrogen公司）；限制性内切酶BamHⅠ,

4、NotⅠ,OneStepRNAPCRKit(AMV)，pMD18Tvector,T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；MarkerⅢ,Ⅳ,Ⅶ（天为时代公司）；PCR扩增仪(T1,D18Tvectorkit说明书进行连接反应，于16℃条件下连接30min，在4℃条件下连接过夜，构建重组质粒pMDTSLC1，将重组质粒转化入感受态JM109受体菌中，将转化的受体菌涂布在含50mg/L氨苄青霉素的LB培养板上并进行蓝白筛选，37℃培养16h.从LB培养板上随机挑取单菌落，接种于氨苄青霉素的LB培养液中，37℃震荡培养过夜，

5、从菌液中提取质粒进行PCR反应，挑选阳性克隆进行酶切鉴定，自动测序仪测序，用chromas软件分析测序结果.1.2.5真核表达载体的构建及鉴定分别用测序正确的重组质粒和质粒pcDNA3.1(+)进行BamHⅠ，NotⅠ双酶切，酶切产物用8g/L琼脂糖凝胶电泳，回收约1413bp的TSLC1片段和5400bp的pcDNA3.1(+)片段，将线性化的载体片段与回收的TSLC1片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，采用氨苄抗性筛选，挑取阳性克隆扩增并小量提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定［3］

6、.2结果2.1总RNA的提取提取的总RNA进行甲醛变性电泳，有2条明显的电泳条带，分别对应28S，18S，A260nm/A280nm在1.8～2.0之间，表明获得的RNA完整无降解，满足下一步实验要求.2.2RTPCR利用自行设计的一对引物，通过RTPCR方法从上皮组织中扩增出一条长度约为1413bp的单一条带,与理论预计的cDNA片段长度一致(图1).2.3PCR产物的克隆及鉴定将回收的TSLC1扩增片段克隆入pMD18T，转化入JM109受体菌，小提质粒，用特异引物进行PCR反应（图2）.再选取PCR呈现阳性的质

7、粒进行BamHⅠ和NotⅠ双酶切（图3）.对鉴定为阳性的重组质粒进行测序的结果表明克隆的DNA片段与GenBank收录的TSLC1cRNA序列(序列号：AY358334)完全一致.2.4真核表达载体的构建及鉴定将pMDTSLC1重组质粒和pcDNA3.1(+)载体分别进行限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切后分别回收约1413bp的TSLC1片段和5400bp的载体片段，将两者连接重组质粒，PCR增出一条长度约为1413bp的单一条带、双酶切后电泳可观察到有约1413bp的TSLC1条带和5400bp的pcDNA3.1

8、(+)条带和测序鉴定结果表明克隆的DNA片段与GenBank收录的TSLC1序列完全一致(图4).3讨论1998年Murakami等［4］发现，在79个非小细胞肺癌患者中，有25个患者的染色体在11q23处出现杂合性缺失，推测该处可能为抑癌基因缺失，并分离出一段1600bp的基因片段，转染非小细胞肺癌细