中国春小麦puroindoline+a基因克隆和真核表达载体构建

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1、AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheMasterDegreeofScienceCloningofpuroindolineaGenefromCommonWheat(TriticumaestiumL.cv.ChineseSpring)andConstructionofEukaryoticExpressionVectorCandidate:TaoHongmeiMajor:BiochemistryandMolecularBi

2、ologySupervisor:Prof.HeGuangyuanHuazhongUniversityofScienceandTechnologyWuhan,Hubei430074,P.R.ChinaMay，2007本研究课题得到国家973计划项目2002CB111301和国家自然科学基金30370807资助。独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研

3、究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“

4、√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月华中科技大学硕士学位论文摘要puroindoline基因(pin)位于小麦5D染色体短臂上的Hardness位点，包括puroindolina基因（pina）和puroindolinb基因(pinb)，它们共同控制着小麦籽粒硬度。这两个基因分别编码PuroindolineA(PINA)和PuroindolineB（PINB）两种蛋白，它们位于淀粉粒和蛋白基质表面，是小麦籽粒硬度的生化标记。PINA蛋白和PINB蛋白都有一个富含色氨酸的结构

5、域，它是PIN的主要功能基团，这个富含色氨酸的结构域除了影响籽粒硬度外，还具有较强的抗菌活性，对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌都有较强的抗菌作用。为了研究PINA蛋白的这些功能，本论文构建了真核表达载体PcDNA3.1(+)-pina-gfp为pina基因在哺乳细胞中的表达提供了基础。我们用PcDNA3.1(+)-gfp和pVIVO作为载体，构建pina基因的真核表达载体，并成功的将PcDNA3.1(+)-pina-gfp载体在中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）中获得瞬时表达，验证了真核表达载体在细胞中表

6、达的可行性。本文成功构建了PcDNA3.1(+)-pina-gfp和pVIVO-pina两个真核表达载体，在载体构建过程中，摸索了载体构建过程中的条件，丰富了载体构建过程中的实验参数，提高了实验的成功率，在真核细胞中大量表达PINA蛋白，可以为研究该蛋白的高级结构，进而有望阐明蛋白功能的机制提供材料。此外，如果将载体转入到真核细胞中经过表达，将获得动物对该目的基因翻译转录蛋白免疫产生的抗体，这两个方面的工作都为将来更为深入的研究PIN蛋白的结构功能打下了坚实的基础。关键词：puroindoline

7、a；基因克隆；真核表达载体构建；小麦I华中科技大学硕士学位论文AbstractThepuroindolinegeneislocatedinHa(Hardness)locusontheshortarmofchromosome5Dwhichcontainespuroindolinea(pina)andpuroindolineb(pinb),andplaysanimportantroleindeterminingwheatseedhardness.ThetwogeneswhichencodePuroin

8、dolineA(PinA)andPuroindolineB(PinB)proteinareonthesurfaceofstarchgranulesandthematrixproteins,whichisregardedasbiochemicalmarkerofwheatgrainhardness.Particularly,PinAandPinBareuniquebecauseoftheirtryptophan-rich,hydrophobicdomains,whichcontrib