特异种质烟草全长cdna文库构建及fesod基因克隆和表达

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1、学位论文独创性声明本人郑重声明：1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。Y6426952、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。3、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。作者签名：日期：型鲨：生一学位论文使用授权声明本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版：有权将学位论

2、文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。作者签名：日期：王塑生：生摘要特异种质烟草全长eDNA文库构建及FeSOD基因的克隆与表达要病虫害和各种恶劣环境是造成包括烟草在内的绝大多数农作物减产的主要因素，在烟草生产上，仅烟草花叶病一项每年造成的经济损失就十分巨大。因此，培育抗病、抗虫和抗逆的作物品种是育种工作者长期而艰巨的任务。要培育出高质量的抗病、抗虫和抗逆品种，除了拥有抗性种质资源外，还必须建立抗性资源合理开发

3、利用的有效途径和方法。我屡特有的地方烟草品种HZNH具有很强的抗病、抗逆能力，含有丰富的抗病、抗逆基因和发达的保护酶系统。为了研究其抗病、抗逆的分子机制和分离、克隆其中的抗病、抗逆基因，我们采用SMART(SwitchingMechanismAt5’endofRNATranscript)技术构建了HZNH的全长eDNA基因文库。大肠杆菌XLl-Blue平皿测定和PCR快速鉴定表明，文库的库容量为2．47×106pfu／ml，重组率为98．4％，所构建的文库达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。以所建文库的噬菌体DNA为模板，根据国

4、外已报道的FeSOD的保守序列先扩增到FeSOD部分cDNA序列，在其内部设计了两个特异性引物，分别与文库载体臂上的通用接头引物配对，运用RACE的方法，分别扩增出cDNA的3’端和5’端，从而得到全长cDNA序列，与国外已报道的FeSODcDNA序列同源性达97．69％，因此成功的克隆到了烟草特异品种HZNH的FeSODeDNA全长基因，为今后研究FeSOD的结构与功能提供了更多的信息，从而为进～步开展FeSOD的基因工程研究打下了良好基础。以克隆的特异种质烟草HZNH的FeSOD基因为基础，构建了原核表达载体PQE30a／FeSOD，经限

5、制性内切酶BamHI、PstI双酶切鉴定后，再转化入大肠杆菌M15中，通过IPTG诱导，得到高效体外表达，经SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，表达的目的蛋白占总菌体蛋白的37％，可溶性和包涵体两种形式均有存在，上清中的可溶性蛋白经FeSOD酶活测定和同工酶活性谱帝分析，表明诱导表达的上清中的目的蛋白为有活性的FeSOD酶。关键词：特异种质：烟草；cDNA文库；FeSOD基因；克隆；表达AbstractFull·lengthcDNALibraryConstructionfromaLocalTobaccoGermplasm，FeSODGeneClo

6、ninganditsProteinExpressionPlantdiseases，pestsandvariousexecrableenvironmentsconstituteprominentfactorsthatleadtocropyieldreduction．Tobaccoisvulnerabletothesefactorsaswell．Wheretobaccoproductionisconcerned，enorlnousamountsofeconomiclossarecausedbytobaccomosaicvirusalone．The

7、refore，itisaHerculeanandlong-termtaskforplantbreedingworkerstocultivatethegermplasmsofresistancetothesefactors，Tofulfillthisaim，weneednotmerelytopossesstheresistantgermplasms，butalsotoworkouteffectivemethodstodevelopandapplythem．TheHZNH，alocaltobaccogermplasm，hasbeenfoundto

8、havethecapacitytoresistdiseasesandadversityenvironmentinthatitisendowedwithavariet