人RBP4基因cDNA全长的克隆,表达和纯化

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1、人RBP4基因cDNA全长的克隆、表达和纯化孙玉秀1，鲁云霞安徽省教育厅自然科学基金资助项目（No2006kj371B）第一作者：孙玉秀（1981-），女，硕士研究生，E-mail：syx1981@gmail.com；通讯作者：鲁云霞（1969-），女，副教授，研究方向：糖尿病的分子机理，Tel：0551-5161131，E-mail：luyunxia0514@tom.com1，汪凌云1，陈兵1，陈利春2，陈冠军1（1安徽医科大学基础医学院生化教研室，安徽合肥2300322安徽省合肥市妇幼保健院，安徽合肥230001）中国图书分类号：R345.61摘要：目的构建人视黄醇结合蛋白4(RBP4

2、)基因cDNA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hRBP4)并在大肠杆菌中高效表达。方法　取成人正常肝脏组织提取总RNA，RT-PCR后的扩增产物回收，构建克隆载体pMD-RBP4，设计带酶切位点BamHⅠ和HindⅢ的引物，PCR后酶切连入pET-28a(+)中，转化BL21(DE3)，测序后IPTG诱导表达，Westernblot检测其特异表达，并对rhRBP4诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化，进一步用镍亲和层析柱进行纯化，SDS-PAGE鉴定其纯度。结果　测序证实所得的hRBP4cDNA序列与其在GenBank中的序列一致，重组质粒pET-28a(+)-R

3、BP4的双酶切结果与预期大小完全一致，IPTG诱导后高效表达的蛋白质是其不溶性的包涵体形式；Westernblot结果证实其高效表达的确实是RBP4。IPTG诱导的最佳浓度是0.04mmol·L-1，时间为6h，温度为37℃，镍亲和层析后经电泳证实其纯度可达96%。结论　成功克隆和构建了人RBP4基因的原核表达载体并对原核体系诱导表达的条件进行了优化，使其能在BL21(DE3)中高效表达，经亲和层析得到的纯化重组蛋白可用于制备相应的多克隆抗体。关键词:人视黄醇结合蛋白4；pET-28a(+)；高效表达；包涵体；镍亲和层析Cloning,expressionandpurificationof

4、humanRBP4inE.coliSUNYu-xiu1,LUYun-xia1，WANGLing-yun1,CHENBing1,CHENLi-chun2,CHENGuan-jun1(1DeptofBiochemistryandMolecularBiology，AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032，2HefeiMaternalandChildHealthHospital.Hefei230001，Anhui,China)11Abstract：ObjectiveToconstructtherecombinantplasmidpET-28a(+)-hRBP4withh

5、umanretinolbindingprotein4(RBP4)fulllengthcDNAsequence,toexpressthehRBP4proteineffectivelyinE.Coli.MethodsTotalRNAwasisolatedfromthenormalliverofhuman,thenRBP4wereamplifiedbytwo-stepRT-PCR.ThecloningplasmidpMD-hRBP4wasconstructedafterretrievaloftheamplificationproducts,thenRBP4wassubclonedwithprim

6、erscontainingrestrictionendonucleasesrecognitionsitesofBamHⅠandHindⅢ,ligatedintopET-28a(+),transductedintoBL21(DE3).Aftersequenced,thebacteriawereinducedwithIPTGandproteinswereexpressed,identifiedwithSDS-PAGEandWesternblot.Theninductionconditionsofhighlevelexpressionwereexperimentedandthefusionpro

7、teinexpressedinE.colifollowingIPTGinductionwaspurifiedbyNi2+affinitychromatography.ThepuritywasdetectedwithSDS-PAGE.ResultsThesequencingresultprovedthattheclonedhRBP4cDNAsequencewasuniformwithitssequenceinGenbank