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时间:2018-11-10
《hpv16 l1真核表达质粒的构建及其免疫小鼠特》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、HPV16L1真核表达质粒的构建及其免疫小鼠特【摘要】 目的探讨HPV16型L1基因片段免疫小鼠的作用,以期为HPV16预防疫苗的研制奠定基础。方法利用基因工程技术构建HPV16L1真核表达质粒pcDNA3-HPV16L1,在证明该构建系统能在真核细胞7721中有效表达后,用此质粒肌内注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清相应抗体。结果pcDNA3-HPV16L1质粒DNA能在小鼠体内表达并诱导产生HPV16型特异性抗体。结论HPV16L1基因片段可诱导机体产生特异性抗体,为HPV核酸疫苗的研究奠定了理论和实验基础。【关键词】乳头瘤病毒;人;克隆;分子;疫苗;小鼠
2、 人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)是一类严重威胁人类健康的DNA肿瘤病毒,高危型人乳头瘤病毒HPV16的感染与宫颈癌的关系已被流行病学、组织病理学和分子生物学的众多证据所证明。研究发现在真核或原核细胞中表达的HPV16主要衣壳蛋白(L1)具有自身装配成病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLP)的特性[1],与天然的病毒颗粒具有相似的结构,有很强的免疫原性和免疫综合性,可以刺激机体产生中和性抗体IgG、IgA[2],能保护动物免受相同型别HPV的攻击,是目前疫苗构建中常用的保护性抗原,与重组腺病毒疫苗相比,DNA疫苗具有制备简单有效的
3、特性,是有广泛用应前景的第3代疫苗。因此本实验构建了HPV16主衣壳蛋白(L1)的真核表达质粒,在充分证明其在哺乳动物细胞中能有效表达HPV16L1蛋白的基础上,进一步研究重组真核表达质粒的免疫原性,以探讨研制可预防HPV16感染的核酸疫苗的可行性及有效性。 1材料 1.1质粒、菌种和细胞株质粒p16L1BN1(含HPV16L1全长基因,由于修平教授构建惠赠),真核表达载体pcDNA3.0(含CMV启动子)、大肠杆菌DH5α及TA克隆载体pMD18-T(大连宝生物公司产品);7721人肝癌细胞株购于中国科学院上海细胞所。 1.2试剂限制性内切酶BamHI,HindIII,X
4、balI,T4连接酶,DNAMarkerλ-EcoT141,DNAMarkerλ-HindIII及PCR扩增试剂盒均为大连宝生物公司产品;质粒提纯及酶切片段回收试剂盒为Qiagen公司产品。Lipofectamine2000Reagent,胎牛血清,RPMI1640购自GIBCO公司。G418购自上海生工生物工程有限公司。鼠抗HPV16L1单克隆抗体由卞继峰博士(山东医科大学分子生物学实验室)提供,羊抗鼠IgG-HRP和TMB购自北京中山生物公司。低分子量标准蛋白质为Pharmacia公司产品。HPV16VLPs由美国癌症研究中心Schiller教授惠赠。 1.3动物BALB/
5、c小鼠,雌性,4~6周龄,体质量(20±2)g,购自华中科技大学同济医学院实验动物学部。 2方法 2.1PCR扩增目的片段 特异性引物P1、P2序列如下:P1:GCAAGATCTATGTCTCTTTGGCTGCCTAGT;P2:AGCAGATCTTTACAGCTTACGTTTTTTGCG上下游引物前各加入BglII内切酶识别序列(画线部分)。以质粒p16L1BN1为模板,按照94℃变性3min,然后94℃45s,60℃45s,72℃1.5min,循环30个周期后,72℃延伸7min,1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 2.2HPV16L1T-A克隆构建 PCR产物3’端多
6、出的A碱基与载体pMD18-T的5’端的T碱基互补,于16℃连接过夜,以常规CaCl2法转化感受态DH5α,在含有氨苄的LB平板上37℃培养过夜筛选阳性菌落,BamHI单酶切鉴定重组子pT-A16L1。 2.3HPV16L1真核表达质粒pcDNA3-HPV16L1的构建 重组体pT-A16L1经HindIII,XbalI双酶切,回收HPV16L1片段(约1.52kb)。真核表达载体pcDNA3.0同样经HindIII,XbalI双酶切回收,与回收的HPV16L1片段以1∶3的摩尔比混合,16℃连接过夜,转化感受态DH5α,在含有氨苄的LB平板上37℃培养过夜筛选阳性菌落。Hi
7、ndIII,XbalI双酶切鉴定重组质粒pcDNA3-HPV16L1,同时进行克隆片段全长测序(上海生工生物工程有限公司完成),以检查重组质粒中克隆片段核苷酸序列的改变情况。 2.4细胞转染及筛选将7721人肝癌细胞株接种于6孔板中,37℃5%CO2条件下培养至80%汇合时,用脂质体转染的方法分别导入经PEG法纯化的质粒pcDNA3-HPV16L1和空载体pcDNA3.0,在含有G418的RPMI1640中培养48h,筛选阳性转化细胞,G418的有效浓度为400μg·ml-1。
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